研究背景棘阿米巴角膜炎(Acanthamoeba keratitis, AK)是棘阿米巴原虫感染角膜引起的一种严重的致盲性眼病。近年来,随着角膜接触镜的广泛使用,其发病率迅速升高。AK的发病与角膜创伤、接触污水源、配戴角膜接触镜明显相关,其中配戴角膜接触镜是其最主要的危险因素。研究报道,每百万个角膜接触镜配戴者中,AK的罹患者美国为1.36人,荷兰为3.06人,英国为17.53-21.14人；在我国报道的第一例AK是由角膜接触镜引起,并且与接触镜相关性AK,约占AK患者的30.8%。由于棘阿米巴包囊具有很强的环境适应性、抗药性并能长期缓慢在角膜生长,导致该病药物治疗效果差、术后易复发,使AK成为临床上治疗非常棘手、具有较高致盲率的角膜感染。因此,认识角膜感染发病机制和揭示宿主抗棘阿米巴感染的免疫防御机制具有至关重要的意义。角膜上皮细胞是角膜抵抗病原体感染的第一道屏障,也是角膜天然免疫防御系统的主要组成细胞,有赖于其模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)对特定病原体的快速识别,通过产生丰富的炎性因子、炎性介质及抗菌肽等激活防御系统,清除病原。Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)是一种重要的PRR,它通过识别许多病原微生物共有的特殊结构-病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs)激活细胞内的信号级联反应,诱导炎性细胞因子的生成和释放,趋化炎性细胞浸润,启动炎症和免疫反应,从而在防御细菌、真菌、病毒等病原体入侵中发挥重要作用。Toll样受体4(TLR4)是人们最早发现的TLR,其主要表达于免疫细胞如淋巴细胞、单核巨噬细胞等,也可以表达宿主-环境接触处的上皮细胞如呼吸道上皮细胞和肠上皮细胞等。TLR4识别相应配体后,可通过MyD88依赖途径或MyD88非依赖途径,激活下游信号通路,最后活化核转录因子(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB)、干扰素调控因子-3(interferon-regulated factor-3, IRF-3)等转录因子,诱导宿主细胞表达炎性细胞因子,诱导炎症反应和启动先天免疫。我们的前期研究发现,在人角膜上皮细胞中TLR4为阳性表达；应用棘阿米巴原虫刺激人角膜细胞检测TLR1-10表达的变化,发现TLR4显著升高,说明TLR4可能参与棘阿米巴角膜炎的炎症反应。众所周知,氧是人体新陈代谢和生命活动的关键物质,同时组织氧分压的变化也是重要的环境信号,参与机体的许多生理和病理过程如炎症、感染、缺氧等。角膜代谢所需要的氧80%来自外界空气,接触镜附着于角膜表面,使角膜处于低氧环境,从而影响角膜上皮细胞的生物特性,如上皮细胞水肿、凋亡、坏死、脱落等,破坏上皮屏障功能,降低上皮细胞的天然防御功能。研究发现低氧可促进绿脓杆菌对角膜上皮细胞的粘附、减少上皮细胞增殖、加速细胞凋亡,增加角膜上皮细胞对绿脓杆菌的易感性。近年研究发现低氧能够调控TLR4基因的表达,但因细胞类型和低氧培养条件的不同,低氧对TLR4的调控作用有所差异,然而低氧对人角膜上皮细胞TLR4的调控研究,目前尚未见相关报道。既然TLR4参与棘阿米巴角膜炎的炎症过程,因此有必要对低氧是否调控人角膜上皮细胞TLR4及其信号通路、低氧是否通过调控TLR4而影响角膜上皮细胞对棘阿米巴的易感性进行深入研究,这将为有效地预防角膜棘阿米巴感染提供新的思路。本研究分为两个部分：一、应用棘阿米巴刺激人角膜上皮细胞,检测TLR4基因与炎性因子白介素6(interleukin-6, IL-6)和IL-8分泌的变化,并应用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术沉默TLR4基因的表达,检测抑制TLR4后对炎性因子表达的影响,探讨TLR4在人角膜上皮细胞对棘阿米巴刺激的天然免疫反应中的作用。二、通过检测低氧对棘阿米巴刺激角膜细胞诱导的TLR4基因,下游信号通路蛋白髓样分化因子88(myeloid differentiation primary response gene88, MyD88)、NF-κB和细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular signal regulated protein kinase1/2, ERK1/2),以及炎性因子IL-8和干扰素-β(interferon-β, IFN-β)表达的影响,探讨低氧是否通过调控人角膜上皮细胞TLR4及其信号通路,从而影响角膜棘阿米巴感染的炎症反应,分析低氧对棘阿米巴角膜炎易感性的影响,揭示角膜接触镜配戴易患棘阿米巴角膜炎的原因,这将为棘阿米巴角膜炎的合理预防和治疗策略提供理论依据。第一部分Toll样受体4介导人角膜上皮细胞对棘阿米巴的天然免疫反应目的：研究Toll样受体4在人角膜上皮细胞对棘阿米巴炎性反应中的作用。方法：1.培养永生化的人角膜上皮细胞(telomerase-immortalized human epithelial cells, THCEs)和棘阿米巴虫株。先用不同浓度(1×103/ml、1×104/ml、1×105/ml、1×106/ml)的棘阿米巴刺激THCEs30min,孵育12h后收集细胞,Real Time-PCR检测TLR4mRNA的表达,Western blot检测TLR4蛋白表达。用1×106/ml浓度棘阿米巴刺激THCEs,于刺激的不同时间点(1h、3h、6h、12h)收集的细胞分别采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, Real-time PCR)和Western blot检测TLR4mRNA和蛋白表达；收集的培养上清采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测炎性细胞因子IL-6和IL-8水平。2.设计、合成特异性针对TLR4基因的小干扰RNA (small interference RNA, siRNA)序列：正义链为5’-GGCAAUUCUUUCCAGGAAATT-3’;反义链为5’-UUUCCUGGAAAGAAUUGCCAG-3’。阴性对照选择与人类基因没有任何同源的干扰序列,正义链为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’;反义链为5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。采用脂质体(Lipofectamine)2000介导TLR4-siRNA及阴性对照siRNA(NC-siRNA)转染THCEs48h后,利用Real-time PCR和Western blot检测TLR4的：mRNA和蛋白表达以评价抑制效果。利用棘阿米巴(1×106/m1)分别刺激转染TLR4-siRNA及NC-siRNA的THCEs30min,孵育12h后利用ELISA检测上清中细胞因子IL-6和IL-8的表达。结果：1.随着棘阿米巴刺激浓度的增加,人角膜上皮细胞TLR4的mRNA和蛋白表达逐渐升高；在1×106/ml的棘阿米巴刺激浓度下,人角膜上皮细胞TLR4mRNA和蛋白表达在刺激后6h开始升高,并以时间依赖方式呈现上调。棘阿米巴刺激人角膜上皮细胞6h后,IL-6和IL-8的分泌明显升高,随着刺激时间的延长进一步上调。2. TLR4-siRNA转染人角膜上皮细胞后,TLR4mRNA及蛋白水平表达均受到显著抑制。棘阿米巴刺激后TLR4-siRNA处理组IL-6和IL-8的分泌水平较NC-siRNA组显著降低。结论：TLR4是人角膜上皮细胞识别棘阿米巴的重要受体并介导炎性细胞因子IL-6和IL-8的的表达,TLR4-siRNA可通过下调炎性因子的分泌达到抑制棘阿米巴角膜炎炎症反应的目的,为探索治疗角膜棘阿米巴感染的新方法提供了理论依据。第二部分低氧抑制Toll样受体4介导的人角膜上皮细胞对棘阿米巴的天然免疫反应目的：研究低氧对TLR4介导的人角膜上皮细胞对棘阿米巴炎性反应的调控作用。方法：1.培养永生化人角膜上皮细胞(THCEs)和棘阿米巴虫株。THCEs分别置于常氧(21%02)和低氧(1%02)条件下37℃培养24h,设置空白对照组和棘阿米巴刺激组(1×106/m1)。采用Annexin V-PE与7-AAD双染法检测细胞的生存活性。2.在常氧条件下,用棘阿米巴原虫(1×106/m1)刺激已预先在低氧孵箱培养24h的THCEs30min后,再放入低氧孵箱孵育6h。收取的细胞利用Real-time PCR检测TLR4MyD88IL-8和IFN-p mRNA的表达；利用Western blot检测TLR4、NF-κB抑制蛋白α (IκBα)、磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IκBα)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)的蛋白表达。收取的上清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎性细胞因子IL-8和IFN-p的分泌。3.在低氧条件下孵育THCEs,于不同的时间点(0h、6h、12h、24h、48h)收集细胞,分别采用Real-time PCR和Western blot检测TLR4mRNA和蛋白表达。4.将THCEs在低氧环境中孵育24h后,用TLR4的公认配体脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)(1μg/ml)刺激6h。收取的细胞利用Real-time PCR检测MyD88、IL-6、和IL-8mRNA的表达；利用Western blot检测IκBα和p-IκBα的蛋白表达。结果：1.流式细胞技术分析细胞生存活性,显示低氧和棘阿米巴刺激对THCEs的生存活性均无显著影响。2. Real-time PCR结果显示,低氧可以下调棘阿米巴刺激THCEs引起的TLR4和通路分子MyD88的mRNA表达；Western blot结果显示,低氧可以降低棘阿米巴刺激THCEs引起的TLR4、p-IκBα和p-ERK1/2的蛋白表达,明显升高IκBα的表达；ELISA结果显示,低氧可以抑制棘阿米巴诱导的炎性细胞因子IL-8和IFN-β的分泌。3. Real-time PCR和Western blot的结果显示,低氧分别孵育THCEs24h和48h小时后,TLR4的mRNA和蛋白水平均明显减低。4.LPS刺激试验结果显示,低氧可以降低MyD88mRNA的表达,抑制IκBα的磷酸化,下调炎性细胞因子IL-6和IL-8的分泌。结论：低氧通过抑制TLR4的表达及其信号通路的活化,从而抑制人角膜上皮细胞对棘阿米巴刺激引起的炎性反应。低氧可能通过减弱人角膜上皮细胞抵抗棘阿米巴入侵的能力,从而增加细胞的易感性。这些发现可能解释了配戴角膜接触镜是棘阿米巴角膜炎最主要的危险因素的原因。