丝氨酸蛋白酶是一类重要的水解酶,得名于Ser对底物的亲核攻击。丝氨酸蚩白酶作为蛋白酶家族的重要成员,其作用是断裂大分子蚩白质中的肽键,从而使大分子蛋白质转变成为小分子物质。丝氨酸蛋白酶的催化作用是通过其活性中心的催化三联体变化实现的,它们之中一定有一个是丝氨酸,故得名丝氨酸蛋白酶。丝氨酸蛋白酶在哺乳动物体内有着非常重要的功能,消化酶、凝血因子以及补体系统中的很多成员都属于丝氨酸蛋白酶。由于丝氨酸蛋白酶在胚胎发育、细胞分化、组织重建、血管形成和防止病原侵入等方面起着非常重要的作用,因此关于动物丝氨酸蛋白酶的研究报道比较多。但是,有关昆虫丝氨酸蚩白酶的研究报道仍然还是比较少。Ross等人(2003)利用果蝇基因组数据,对果蝇中的丝氨酸蛋白酶基因家族进行了鉴定,共获得了119个基因。对该基因家族进行进化分析,发现基因重复和变异在该家族的形成过程中具有非常重要的作用。家蚕基因组中同样有众多的基因编码丝氨酸蚩白酶。在家蚕不同的组织中,含有多种丝氨酸蛋白酶。赵萍等人依据家蚕基因组数据库中的数据,参照其他物种中丝氨酸蛋白酶基因的序列,全面分析并鉴定了家蚕中的丝氨酸蛋白酶基因。在家蚕基因组中总共鉴定到143个丝氨酸蚩白酶基因,比果蝇中的119个基因多了24个。并对这些基因进行了系统的命名,分别记为BmSP1～BmSP143。它们的分子量和等电点的分布比较广泛。氨基酸序列比对分析发现,家蚕中丝氨酸蛋白酶按活性位点的完整性可分为两类：一类是3个活性位点完整的SP类,有51个丝氨酸蛋白酶基因,另一类则是活性位点不够完整的SPH类。家蚕丝氨酸蛋白酶的功能广泛,已有功能研究报道的家蚕丝氨酸蛋白酶包括：茧酶、卵黄蛋白降解蛋白酶、中肠碱性蛋白酶和卵巢蛋白酶等,它们的功能涉及到卵的形成、胚胎发育、消化,甚至丝蚩白的形成等领域,表明丝氨酸蛋白酶在维持家蚕的正常生长发育等生理活动中是不可缺少的。家蚕中的丝氨酸蛋白酶除了含有催化结构域,还可能会含有其他的结构域。例如,有的丝氨酸蛋白酶含有CUB结构域。CUB结构域是含有大约110个氨基酸的胞外结构域,因最初在三类蛋白中被鉴定到而得名,它们分别是Complement subcomponents Clr/Cls,Uegf和Bone morphogenic protein-1。含有CUB结构域的蛋白有多种功能,它们都与生长发育相关。CUB结构域通常与其他结构域偶联出现,其中包括丝氨酸蚩白酶结构域。很多包含CUB结构域的蚩白含有复合CUB结构域和复合蛋白酶结构域。它们在细胞分化,生长因子激活,降解多肽,细胞外生长发育进程中发挥着重要的生理功能。家蚕是一种经济昆虫,能够分泌大量的丝纤维,在纺织工业中具有重要的经济价值。丝腺作为家蚕唯一的泌丝器官,具有很高的研究价值,对家蚕丝腺吐丝机制的研究能够有望提高蚕丝的产量和质量,产生巨大的经济效益和社会效益。本实验室在先前的研究中,通过对家蚕基因组芯片数据进行分析,发现家蚕丝氨酸蛋白酶基因BmSP82是家蚕丝腺中表达量最高的一种丝氨酸蛋白酶,并且在家蚕的前部和中部丝腺特异高量表达。丝氨酸蛋白酶基因BmSP82的功能研究有助于阐明丝氨酸蛋白酶在丝腺中具有的独特功能,促进我们对家蚕丝腺分泌丝蚩白的作用机制的理解,从而提高蚕丝的质和量,为生产作出贡献。综上所述,我们选取了BmSP82作为研究对象。首先,对BmSP82进行了序列比对和信息分析,利用RT-PCR分析了其组织和时期表达特征。通过原核表达获得了BmSP82成熟体的重组蛋白,通过注射小鼠进一步制备了BmSP82的多克隆抗体,然后利用多克隆抗体检测了BmSP82在家蚕体内的存在形式,利用BmSP82的CUB结构域抗体进行了组织定位；最后利用原核表达系统和酵母真核表达系统探究了BmSP82的酶活性。主要结果如下：1、家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP82的生物信息及表达特征分析；BmSP82基因在SilkDB上的编号是BGIBMGA004445,基因定位于家蚕大造的第20号染色体上,具体位置为：nscaf2795:1108881..1115723(+strand)。芯片数据和RT-PCR结果表明,BmSP82基因主要在家蚕的马氏管和丝腺的前部和中部有表达。结构域预测结果表明BmSP82基因编码的丝氨酸蛋白酶是一个含有CUB结构域和胰蛋白酶结构域的丝氨酸蛋白酶。信息分析发现,它的前17个氨基酸为其信号肽序列,信号肽之后的N端含有一个由114个氨基酸残基组成的CUB结构域,CUB结构域中含有8个半胱氨酸。C端含有一个胰蛋白酶类结构域,结构域中含有完整的三个保守氨基酸残基：组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)和丝氨酸(Ser),它们是丝氨酸蛋白酶的催化三联体。胰蛋白酶结构域中也含有8个半胱氨酸。两个结构域之间由18个氨基酸残基连接,连接部分含有2个半胱氨酸,酶原激活位点为异亮氨酸(Ⅰ)。2、家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP82的原核表达和抗体制备；通过对BmSP82的序列分析,设计了表达引物,以家蚕5龄3天丝腺cDNA为模板进行PCR,并将目的片段亚克隆到p28(pET28a改造)载体上,测序成功后转化到表达菌株Transetta(DE3)内,表达检测发现BmSP82以包涵体形式表达。于是进行切胶纯化,将重组蛋白注入昆明鼠体内,经过30多天的饲养,得到了效价为1：10000的多克隆抗体。3、家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP82的蚩白水平的时空表达分析；利用制备的多克隆抗体,检测到BmSP82在家蚕的丝腺和马氏管中有表达。进一步的检测发现BmSP82在家蚕的前部丝腺和中部丝腺中有表达,在后部丝腺中没有表达。对丝氨酸蚩白酶BmSP82在家蚕中部丝腺前区进行了组织定位,发现其主要分布在家蚕中部丝腺前区的丝腺细胞层以及丝腺内膜和丝腺腔的儿丁质层之间,表明其可能参与了中部丝腺前区腔内细胞外基质的形成,从而保护丝腺细胞免受吐丝过程中丝蛋白对丝腺腔内侧细胞的压力和剪切力损伤。4、家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP82的表达及活性初探。通过原核表达获得了带GST标签的BmSP82成熟体,利用GST标签进行了亲和层析,得到了纯度较高的GST-BmSP82重组蛋白。利用TEV酶切除BmSP82重组蛋白的GST标签后与酪蛋白孵育,发现原核表达的BmSP82蛋白没有活性。于是又进行了毕赤酵母真核表达。将丝氨酸蛋白酶基因BmSP82的成熟体片段构建到真核表达载体pPIC9K上,通过电转化转入毕赤酵母GS115中进行培养。最后运用BMGY和BMMY液体培养基体系进行诱导表达。检测到酵母转化子在诱导24h后显著表达,于是进行了硫酸铵梯度沉淀,得到了较纯的BmSP82的成熟体蛋白,为进一步的蛋白酶活性检测与功能研究奠定了基础。