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硒是人体所必需的微量元素,具有参与机体免疫调节、预防癌症、抗氧化等重要的生理学功能。谷物、蔬菜水果等天然食品中的硒含量较低,不能满足人们对于硒的日常膳食需求,而常见的无机硒,亚硒酸钠又具有较强的毒副作用。因此,以微生物为载体高效安全的补硒方法受到了国内外学者的广泛关注。本文研究的主要内容是对筛选得到的富硒优势菌(Lactobacillus plantarumDfa-301)进行诱变育种、发酵工艺条件优化,探讨其应用研究并制得富硒乳酸菌片。(1)选取4种常见的富硒乳酸菌对其耐硒、富硒能力进行比较,以生物量、富硒含量及硒转化率为指标筛选出富硒优势菌。并采用紫外-硫酸二乙酯反复诱变的方法提高菌株的富硒能力,得到最佳复合诱变条件:20 W紫外灯照射60 s,20%DES乙醇溶液诱变20 min,经3次紫外、4轮化学诱变,最终得到一株高生物量高富硒含量的突变株标记为Dfa-301-30,富硒含量为473.275 μg/g,比诱变前提高了 20.51%。(2)通过对发酵培养基碳源、氮源、无机盐离子配比的优化得到最优富硒发酵培养基(改良MRS培养基):葡萄糖20.00 g/L,牛肉粉24.00 g/L,20.00 g/L的Mg2+、K+、NH4+、Ca2+的添加量分别为 0.04 mL、0.60 mL、0.40 mL、0.30 mL/20 mL(发酵液)、吐温80 1 ml/L。研究不同底物浓度、发酵时间、加硒时间、初始pH、接种量对菌体硒含量的影响,采用Box-behnken设计优化得到最佳富硒培养条件为:亚硒酸钠浓度5.0 μg/mL、加硒时间7.6 h、初始pH 5.5、接种量3.0%、培养时间36.0h。优化后,突变株Dfa-301-30硒含量高达839.635μg/g,比优化前提高了 1.77倍。将富硒培养扩大至小型发酵罐,进行补料分批发酵研究。试验结果显示,1 L发酵罐培养96 h菌体生物量为3.8495 g/L,富硒量达到940.329μg/g。(3)将富硒发酵菌体培养物制备成冻干菌粉后添加不同辅料,经处方筛选和工艺优化研制出新型富硒乳酸菌口服片,并对其进行质量评价。最优片剂处方为:富硒冻干菌粉45%(w/w)、填充剂微晶纤维素49.6%(w/w)、崩解剂交联羧甲基纤维素钠1:1内外加法5%(w/w)、润滑剂硬脂酸镁(0.4%)、黏合剂5%PVP(alcohol solution)适量。测得片剂活菌数可达4.87×l07-5.23×l07 cfu/g,抽检3批样品硒含量范围在29.89-30.32μg/片之间,平均硒含量为30.13μg/片;在40℃±2℃,相对湿度75%±5%条件下,放置6个月,菌片性状保持稳定,崩解时限符合要求,有效成分硒含量无显著变化。(4)利用多种分析方法对突变株Dfa-301-30还原底物硒(Ⅳ)生成的红色硒纳米颗粒(SeNPs)进行鉴定及表征。分析结果显示:SeNPs在波长218 nm和268 nm处有较强的紫外吸收峰;SeNPs呈球状,非品态,粒径分布在192.28±26.34nm;FTIR图谱显示SeNPs以SeNPs-生物聚合物的形式稳定存在;Se3d(Se3d5/2和3d3/2)峰位位移表明细胞与SeNPs之间存在相互作用。