论文部分内容阅读
癌症是影响人类生存的重大疾病之一,口腔癌是头颈部较常见的恶性肿瘤之一,它的发生发展是多因素、多阶段的过程。研究表明,细胞的凋亡在口腔癌发生发展过程中起着十分重要的作用。bcl-2、bax蛋白是该领域研究较多的凋亡相关蛋白,国内外学者证实bcl-2、bax等凋亡相关蛋白在口腔鳞癌中都有异常表达。长期以来,有机荧光一直被用来标记生物大分子以研究各种蛋白质之间的相互作用及对细胞的功能的影响。但是由于有机荧光的一些缺点,例如激发光谱较窄,光稳定性差,荧光寿命短等,限制了其作为标记物在生物分子、细胞、体内生物成像研究中的应用。近年来半导体量子点（Quantum dot,QD）由于其独特的光学性质:激发波长的范围宽且连续分布,而发射波长的范围窄且对称分布,并且发光度强,有持久的光化学稳定性等使其在生物医学领域的分子、细胞及体内的成像,尤其在肿瘤学的生物成像技术研究中,前景非常广阔。国内外未见利用量子点对口腔鳞癌细胞bcl-2、bax蛋白进行研究报道。第一章两种粒径量子点分别对口腔鳞癌固定细胞中bcl-2、bax的免疫荧光成像研究目的研究利用量子点优良的光学性质对人口腔鳞癌细胞内bcl-2、bax蛋白进行特异性荧光标记,并与异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate,FITC）标记进行光稳定性比较。方法1.用激光共聚焦显微镜对量子点（QD605和QD545）的荧光和形态进行观察。2.细胞培养:选用人舌癌Tca8113细胞。3.分别利用量子点QD605和QD545通过间接免疫荧光法,对人舌癌Tca8113细胞内bcl-2、bax蛋白进行标记,并在激光共聚焦显微镜下进行观察识别。4.利用异硫氰酸荧光素（FITC）,通过间接免疫荧光法,对人舌癌Tca8113细胞内bcl-2蛋白进行标记,激光共聚焦显微镜下进行观察识别并对QD605和FITC光稳定性比较。5.激光共聚焦显微镜观察时的参数设置:QD605激发光谱波长488nm,激光强度100mW,QD605所用发射光滤光片范围是590-615nm。QD545激发光谱波长456nm,激光强度100mW,QD545所用发射光滤光片范围是535-555nm。FITC激发光谱波长488nm,激光强度100mW,所用发射光滤光片范围是505-530nm。激光连续照射1h,用激光共聚焦显微镜自带软件Leica ConfocalSoftware测量量子点QD605和异硫氰酸荧光素（FITC）的荧光信号强度。结果1.量子点（QD605和QD545）的形态和荧光特点:在激光共聚焦显微镜下量子点（QD605）为接近圆形的红色荧光,最大发射波长为605nm。量子点（QD545）为近圆形的绿色荧光,最大发射波长为545nm。2.激光共聚焦显微镜下可见QD605对存在于人舌癌Tca8113细胞胞浆和核膜中的bcl-2蛋白均标记明显,胞浆和核膜均呈红色荧光。QD545特异性标记的bax主要分布在细胞的胞浆,表现为绿色荧光。3.FITC对存在于人舌癌Tca8113细胞胞浆的bcl-2蛋白标记明显,表现为绿色荧光,对核膜的bcl-2蛋白标记不明显。4.量子点QD605标记的荧光信号比FITC更具特异性,激光连续照射1h,QD605标记的荧光未见明显衰减,而FITC标记的荧光1h内已基本淬灭。第二章口腔鳞癌细胞中bcl-2、bax的量子点双标免疫荧光成像研究目的利用量子点对口腔鳞癌细胞内bcl-2、bax蛋白进行双标免疫荧光成像研究。方法1.细胞培养:选用人舌癌Tca8113细胞。2.利用量子点QD605和QD545通过双标免疫荧光法,在激光共聚焦显微镜下同时对人舌癌Tca8113细胞内bcl-2、bax蛋白进行观察识别。激光共聚焦显微镜下观察方法同第一章。结果不同粒径量子点同时对舌癌细胞bcl-2、bax蛋白的特异性识别,在激光共聚焦显微镜下观察到舌癌细胞bcl-2、bax蛋白均呈高表达。QD605标记的bcl-2蛋白表现为红色荧光,QD545标记的bax蛋白表现为绿色荧光,两种蛋白在细胞内同一位置重叠的部分呈现黄色荧光。激光连续照射1h,3种颜色的荧光均未出现明显衰减。第三章量子点对口腔鳞癌Tca8113细胞的活性影响及活细胞中bcl-2、bax的量子点荧光标记观察目的探讨量子点对口腔鳞癌活细胞的影响及对口腔鳞癌活细胞bcl-2、bax蛋白进行观察研究。方法1.量子点对口腔鳞癌活细胞的影响细胞培养。实验分组:设空白对照组,量子点（QD）实验组。量子点（QD）实验组分4个剂量组,QD终浓度为20nmol/L、30nmol/L、40nmol/L和50nmol/L。每组设6个平行孔。观察分析:将QD不同浓度同步加入到实验各剂量组孔板中,37℃、5%CO2培养箱中培养,分别于实验后4、8、12、16、20h取出96孔板,加入MTT液（20μl/孔）,继续培养4h。吸出孔内培养液,加入二甲基亚砜（DMSO）液（150μl/孔）。室温下,将平板置于微孔板振荡器上振荡10min,使结晶物溶解。酶标仪490nm波长检测各孔OD值,记录结果。统计学分析使用SPSS13.0统计软件进行F检验,P＜0.05有统计学差异。将所测结果进行统计学分析后并绘制空白对照组和不同量子点浓度组细胞生长曲线。2.量子点对口腔鳞癌活细胞bcl-2蛋白进行观察2.1细胞培养。2.2细胞爬片。2.3量子点QD605通过间接免疫荧光法,在激光共聚焦显微镜下观测人舌癌Tca8113活细胞内bcl-2蛋白与量子点孵育0.5h、1.0h、1.5h和2.0h的荧光成像。2.4激光共聚焦显微镜观察,参数设置:激发光谱波长488nm,激光强度100mW,QD605所用发射光滤光片范围是590-615nm。3.量子点对口腔鳞癌活细胞bax蛋白进行观察3.1细胞培养。3.2细胞爬片。3.3量子点QD545通过间接免疫荧光法,在激光共聚焦显微镜下观测人舌癌Tca8113活细胞bax蛋白与量子点孵育0.5h、1.0h、1.5h和2.0h的荧光成像。3.4激光共聚焦显微镜观察,参数设置:激发光谱波长456nm,激光强度100mW,QD545所用发射光滤光片范围是535-555nm。结果1.各组OD值结果显示:在4h、8h时各实验组与空白对照组无统计学意义（P＞0.05）;在12h、16h及20h时,除量子点终浓度为20nmol/L组与空白对照组无统计学意义（P＞0.05）,其它各组与空白对照组有统计学意义（P＜0.05）。2.QD605对口腔鳞癌活细胞中的bcl-2蛋白的观察研究显示:在0.5h时,QD605与bcl-2蛋白结合,红色荧光主要分布于胞浆边缘,接近核膜有一团红色荧光;在1.0h时,红色荧光已分布于胞浆,分布较散,有散在的红色荧光聚集区;在1.5h时,红色荧光分布于胞浆,有较多的红色荧光聚集区;在2.0h时,红色荧光不仅分布于胞浆,部分已到核膜,红色荧光聚集区更加明显。QD545对口腔鳞癌活细胞中的bax蛋白的观察研究显示:在0.5h时,QD545与bax蛋白结合,绿色荧光主要分布于胞浆,分布较散;在1.0h时,绿色荧光分布于胞浆,且绿色荧光较0.5h时集中;在1.5h时,绿色荧光已分布于整个胞浆,且分布均匀;在2.0h时,绿色荧光除分布于胞浆外,部分已分布到核膜。全文结论:1.量子点荧光标记技术能对口腔鳞癌细胞内bcl-2、bax蛋白进行特异性的标记。2.量子点较传统的有机荧光的光稳定性强,不易漂白或光解,适合长时间检测。3.量子点能同时对细胞内的两种蛋白进行双标免疫荧光成像。4.量子点浓度低于20nmol/L时,对细胞活性无明显的影响。5.量子点能对活细胞内蛋白进行观察。