论文部分内容阅读
茵陈蒿汤由茵陈蒿（Artemisia capillaris Thunb.）、栀子（Fructus Gardenia jasminoides Ellis）和大黄（Rheum officinale Baill.）三味常用中药材组成,具有清热、利湿、退黄功效,临床常用于治疗黄疸型肝炎、胆汁淤积、肝硬化腹水等病症。以往在茵陈蒿汤服用或复方颗粒剂等的生产过程中,提取工艺主要采用合煎方法,即三味药材一步煎煮。然而,据《伤寒论》记载,茵陈蒿汤传统煎煮方法为分煎,即茵陈蒿先煎,栀子和大黄后下。不同的煎煮方式可能会引起复方中化学成分变化,进而影响药效。因此,有必要对该方剂的分煎与合煎对复方成分的影响进行系统研究。现代药理学研究表明茵陈蒿汤具有治疗肝损伤作用,但其作用机制尚未明确。随着国际国内对肠道菌群研究的不断深入,发现肠道菌群不仅种类繁多、数量巨大,而且其组成和功能的改变与某些疾病的发生和发展密切相关,如肝损伤、糖尿病、肥胖和抑郁症等。因此,基于“肝-肠轴”理论,初探茵陈蒿汤保肝作用机制,可为后续深入的药理机制研究提供科学线索。本课题采用基于高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱法（HPLC-Q-TOF-MS/MS）的代谢组学技术探究茵陈蒿汤的不同煎煮方法对其化学成分的影响;采用代谢组学技术和16S rRNA高通量测序技术对CCl4诱导肝损伤大鼠的血浆和肠道菌群进行研究,寻找差异性化学成分,保肝作用相关差异性代谢物和代谢通路以及差异菌群,进一步分析差异性代谢物与差异菌群之间的关联性,推测茵陈蒿汤潜在保肝作用机制。主要研究内容及结果如下:1、茵陈蒿汤两种不同煎煮方法对复方化学成分的影响采用HPLC-Q-TOF-MS/MS技术对茵陈蒿汤分煎与合煎的化学成分进行系统分析。将检测数据导入Simca-P软件中进行主成分分析（Principal Component Analysis,PCA）以及正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis,OPLS-DA）,对筛选出的差异性成分进行表征和注释。结果显示,经PCA分析发现两种煎煮方法之间化学成分存在差异,进一步利用OPLS-DA模型筛选出差异性化学成分,比对已有数据库,鉴定出差异性最大的六个化学成分,分别为绿原酸、咖啡酸、京尼平苷、京尼平、东菪莨苷和3,5-二咖啡酰奎宁酸。其中,与合煎相比,分煎茵陈蒿汤中京尼平和咖啡酸含量显著性提高（p<0.01）,这两种成分都有明确的抗肝损伤作用,提示分煎茵陈蒿汤可能具有更好的肝保护作用。本研究为茵陈蒿汤传统煎煮方式提供了科学依据。2、基于代谢组学的茵陈蒿汤保肝作用及肠道菌群研究采用液质联用技术,对CCl4诱导肝损伤大鼠的血浆进行轮廓分析。所得数导入Simca-P软件中进行PLS-DA（偏最小二乘判别分析）和OPLS-DA分析,对所筛选出的差异性代谢物进行表征和注释。将所得差异性代谢物导入Metaboanalyst网站,进行代谢通路分析。结果显示,经PLS-DA分析发现对照组、模型组和茵陈蒿汤给药组血浆中的代谢物存在差异,运用OPLS-DA模型筛选并表征出9个差异性代谢物,分别为3-羟基丁酸、鸟氨酸、L-犬尿氨酸、马尿酸、牛磺胆酸、LysoPC（16:1）、LysoPC（20:3（5Z,8Z,11Z））、LysoPC（17:0）和LysoPC（20:1（11Z））。进一步采用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析,结果显示,茵陈蒿汤的保肝作用主要与精氨酸和脯氨酸代谢、色氨酸代谢、甘油磷脂代谢和原发性胆汁酸生物合成代谢通路有关。采用16S rRNA测序法对大鼠肠道内容物进行菌群测序,所得数据经Linear Discriminant Analysis Effect Size（LEfSe）分析。通过比较正常组与模型组、模型组与茵陈蒿汤给药组大鼠的肠道菌种差异,共筛选出12个差异菌群,如厚壁菌门、拟杆菌门、拟杆菌纲、梭菌纲、拟杆菌目、梭菌目、拟杆菌科、瘤胃菌科、拟杆菌属、粪杆菌真核菌群、不可培养拟杆菌属细菌和不可培养毛螺科细菌。给与茵陈蒿汤干预后,12个差异菌群均有恢复至正常水平的趋势。Pearson相关性分析结果表明,血浆中3-羟基丁酸与肠道菌中梭菌纲和梭菌目相对丰度变化存在很强的正相关性（r>0.8）。推测茵陈蒿汤可能通过调节肠道中梭菌的相对丰度,进而提高血浆中3-羟基丁酸的含量,从而起到肝保护作用。由此可见,茵陈蒿汤的肝保护作用不仅与调控相关代谢通路有关,而且与肠道菌群变化密切相关。上述对茵陈蒿汤不同提取方法化学成分变化的系统研究结果为传统用法的合理性提供了科学依据;采用整体性较强的代谢组学与16s rRNA基因测序相结合方法研究茵陈蒿汤保肝作用机制所获得的初步结果,为更全面认识该经典古方的药效作用和深入研究其药理机制提供了部分线索。