胫骨软骨发育不良(TibialDyschondroplasia,TD)是一种肉鸡中常见的骨骼性疾病,每年给家禽养殖业造成巨大的经济损失。本课题组前期采用基因芯片技术筛选肉鸡TD差异性表达基因,发现谷胱甘肽S-转移酶A3(GSTA3)存在明显差异。GSTA3是GSTs超家族中α家族的一员,具有解毒功能,同时还参与抗氧化应激引起的信号通路调节,另外在类固醇和前列腺素的合成中也必不可少。为全面了解GSTA3在TD发生过程中所起的作用,本试验采用体外原核表达技术制备GSTA3并对GSTA3进行纯化和鉴定。试验采用RT-PCR方法扩增肉鸡GSTA3基因,将扩增产物连接到pZeroBack/blunk克隆质粒后转入大肠杆菌(E.coli)DH5α中进行克隆,并对克隆产物进行PCR产物长度、基因序列鉴定;将GSTA3基因连接至pET-28a,并转入E.coli DH5α中以获得pET-28a-GSTA3重组表达质粒;对pET-28a-GSTA3再次鉴定后,将其转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导E.coliBL21(DE3)进行蛋白表达;应用镍柱亲和层析法纯化表达出的可溶性GSTA3融合蛋白,并对其进行SDS-PAGE、Western Blot鉴定。结果表明:(1)试验成功构建重组克隆质粒pZeroBack/Blunk-GSTA3,测序结果与数据库GSTA3基因同源性为99%,氨基酸的同源性为100%,目的基因GSTA3全长672 bp,有完整的阅读框,编码224个氛基酸;(2)试验成功构建重组表达质粒pET-28a-GSTA3,并转化入E.coli BL21(DE3),当IPTG终浓度为1.0mM、30℃下诱导12h时可获得高效表达的可溶性GSTA3融合蛋白;(3)经SDS-PAGE、Western Blot鉴定,采用镍柱亲和层析法可获得纯度较高的GSTA3融合蛋白,其大小为29.6 kDa,其最佳纯化条件是洗杂液的终浓度为含30 mM咪唑、洗脱液的终浓度为含500 mM咪唑。全文结论:试验成功获得高纯度的可溶性GSTA3融合蛋白,为后续开展TD发生的分子机制研究及其有效防治提供有效保障。