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多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, Pm)是一种重要的畜禽病原菌,属于巴氏杆菌科,主要使动物发生传染性肺炎或出血性败血病。猪巴氏杆菌病主要有猪传染性萎缩性鼻炎(Swine infectious atrophic rthinitis, AR)和猪肺疫(Pneumonic pasteurellosis),这两种疾病给养殖业的发展带来巨大的经济损失。由产毒素多杀性巴氏杆菌(toxigenic Pasteurella multocida, T+Pm)和支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica, Bb)引起的猪传染性萎缩性鼻炎是猪的一种常见且危害严重的传染病。接种疫苗是预防和控制AR的主要手段。研究发现,Bb灭活苗中加入从D型T+Pm中提纯的毒素制成联苗,其免疫效果较常规的灭活菌苗及单纯的类毒素疫苗好,但是提取的巴氏杆菌皮肤坏死毒素(Pasteurella multocida toxin, PMT)在灭活和纯化方面没有得到有效的解决,很难实现规模化生产。随着分子生物学的发展,通过生物技术手段对巴氏杆菌毒素进行分段表达,利用表达产物进行疫苗生产是可行的。本研究将产毒素多杀性巴氏杆菌HN-13株的toxA基因N端的1140bp片段克隆到原核表达载体pET-28a系统中,成功构建了pET28a-toxAN重组表达质粒,经诱导表达,获得大小约为45Kda的融合蛋白rtoxAN,经(?)estern blot检测,证实了rtoxAN蛋白具有良好的免疫原性。将此蛋白和灭活的Bb(HH-0809)与白油乳化制成疫苗,进行了疫苗对小鼠、仔猪、妊娠母猪的安全性以及对小鼠和仔猪的免疫保护力研究。同时还开展了从临床患病猪肺、肾、心、肝、脑和脾等器官中分离鉴定多杀性巴氏杆菌的工作。主要研究内容如下：1.猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定2010年从530份临床患病猪肺、肾、心、肝、脑和脾等器官中共分离出148株多杀性巴氏杆菌,其中A型非产毒素多杀性巴氏杆菌68株；D型非产毒素多杀性巴氏杆菌74株；D型产毒多杀性巴氏杆菌3株；未定型的非产毒素多杀性巴氏杆菌3株。2.PMT毒素的免疫原性研究(1)参照toxA基因序列(NO.AF240778)设计引物扩增toxA基因N端,构建重组质粒pET28a-toxAN,并对其进行诱导表达,Western blot显示表达产物rtoxAN蛋白具有良好的免疫原性,同时对表达产物进行纯化。(2)通过在TSB培养基上增殖培养Bb(HH-0809),收集菌液,进行细菌计数、灭活和浓缩后,和纯化好的rtoxAN蛋白一起与白油乳化制成疫苗,此疫苗中Bb含量为2.0×1010CFU/ml、rtoxAN的含量为100μg/ml。(3)将试制疫苗以每只0.2m1的剂量接种Balb/C小鼠,接种后定期观察,小鼠采食、生长均正常,无异常反应,说明疫苗对小鼠安全。开展了试制疫苗对Balb/C小鼠的免疫保护力试验,将32只4周龄Balb/c雌性小鼠随机分成2组,第1组免疫试制的Bb-toxAN疫苗,第2组注射无菌PBS,首免后2周加强免疫一次。首免后2周、4周分别检测相应的抗体水平。二免后2周,每组一半的小鼠用提取的PMT毒素(6μg)进行攻毒,另一半用5.0×106CFU(10×LD50)HH-0809进行攻毒,观察死亡情况。结果表明,试制疫苗能够激发小鼠产生很高的针对Bb和(?)rtoxAN的IgG抗体；攻毒后,此疫苗针对Bb和PMT毒素的保护率分别为100%和87.5%,而对照组全部死亡。(4)将试制疫苗以每头4m1的剂量分别接种仔猪和妊娠母猪,接种后定期观察,仔猪和妊娠母猪采食、生长均正常,无异常反应,妊娠母猪没有出现早产、流产等现象。说明疫苗对仔猪和妊娠母猪均安全。将15头7日龄的仔猪随机分成3组,第1组免疫制备的Bb-toxAN疫苗,第2组免疫进口的猪萎缩性鼻炎苗,第3组注射无菌PBS,首免后2周加强免疫一次。首免后2周、4周分别检测相应的抗体水平。二免后2周,对所有猪只先用Bb(HH-0809)(3.0×109CFU)滴鼻感染,3天后,所有猪只用PMT毒素(1.2mg/Kg体重)肌肉注射感染,随后观察28天。结果显示两种疫苗均能诱导仔猪产生很高的针对Bb的IgG抗体,但只有Bb-toxAN疫苗组可以诱导仔猪产生很高的针对toxAN的IgG抗体；中和试验表明两种疫苗均能诱导仔猪产生很高的中和抗体；攻毒后发现两种疫苗均可以对仔猪提供80%的保护力。