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血小板是从骨髓成熟巨核细胞脱落下来的小块胞质,其主要功能为止凝血,但在抗细菌感染方面也发挥着重要作用。血小板输注是临床治疗中不可替代的重要方法之一,对于创伤出血、血液系统疾病及败血症患者来说,及时输注血小板不仅可以改善预后,甚至可以挽救患者生命。近年来,随着住院人数的不断增加,血小板的需求缺口越来越大,供不应求已成常态。虽然影响血小板供需矛盾的原因有很多,但血小板的体外保存期过短是其主要因素之一。如果采集量小则不能满足临床需求;而如果大量采集,有效期内没有被使用就必须报废处理。近年研究发现,4℃冷藏可以将血小板的体外保存期从5天延长至14天以上,该方法可以有效解决血小板的供需矛盾问题。但是,在延长体外保存期的同时,4℃冷藏条件会诱导血小板发生冷藏损伤,具体表现在胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的升高、骨架蛋白的受损以及细胞形态的不规则改变等,严重制约着4℃冷藏血小板的大规模临床应用。不仅如此,冷藏损伤是否影响血小板的抗菌功能未见研究和报道。本研究以4℃冷藏血小板作为研究对象,探讨4℃冷藏条件对血小板的损伤作用及其相关机理,为避免或降低血小板的4℃冷藏损伤提供新的理论和实验依据;然后进一步选取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）作为实验细菌,重点探讨22℃保存血小板的抗MRSA功能和4℃冷藏血小板的抗MRSA功效,主要研究内容包括:1.4℃冷藏条件对血小板的损伤作用研究取适量去白细胞单采血小板进行纯化处理,将纯化血小板分别在22℃和4℃保存48小时后37℃孵育1小时。扫描电镜结果显示,22℃保存血小板的细胞膜结构完整,形态规则呈圆形;而4℃冷藏血小板的细胞膜上有小孔出现,细胞形态不规则,有大量伪足伸出。流式细胞术结果显示4℃冷藏血小板的平均细胞膜荧光强度降低。免疫印迹（Western Blot,WB）证实其微管蛋白β3减少。酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）结果显示4℃冷藏血小板上清中的血小板因子4（platelet factor 4,PF4）和五羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）显著升高。这些结果说明4℃冷藏环境可能损伤血小板的细胞结构,特别是细胞膜。2.4℃冷藏条件对血小板的损伤机理探讨取适量纯化血小板,分别在22℃和4℃保存48小时后37℃孵育1小时,进行流式细胞术检测。结果显示,实验组的胞内活性氧类（reactive oxygen species,ROS）水平和[Ca2+]i升高。该结果提示4℃冷藏血小板的细胞损伤可能与胞内ROS水平以及[Ca2+]i的升高有关。取适量纯化血小板,分别用ROS中和剂维生素C（vitamin c,Vc）和等体积PBS预处理,4℃保存48小时后37℃孵育1小时。流式细胞术结果显示Vc组细胞膜的平均荧光强度（mean fluorescence intensity,MFI）升高。WB结果显示Vc组的微管蛋白β3浓度升高。ELISA结果显示Vc组上清中的PF4和5-HT浓度降低。这些结果进一步说明4℃冷藏血小板的细胞损伤可能与胞内ROS水平的升高有关。取适量纯化血小板,分别应用胞内钙离子螯合剂1,2-双（2-氨基苯氧基）乙烷-N,N,N`,N`-四乙酸四乙酸甲酯（1,2-bis（2-aminophenoxy）ethane-N,N,N,N-tetraacetic acid acetoxymethy,BAPTA-AM）和等体积PBS预处理,4℃保存48小时后37℃孵育1小时。流式细胞术结果显示BAPTA-AM组的胞内ROS水平降低且细胞膜的MFI升高。WB结果显示BAPTA-AM组的微管蛋白β3浓度显著增加。ELISA结果显示BAPTA-AM组上清中的PF4和5-HT浓度降低。这些结果说明4℃冷藏血小板的细胞损伤可能是由升高的[Ca2+]i诱导胞内ROS过量生成引起。取适量纯化血小板,分别进行WB、免疫荧光和免疫电镜检测。结果显示血小板上存在瞬时受体电位锚蛋白-1（transient receptor potential anchor protein-1,TRPA1）,且定位在血小板胞内的内质网、致密颗粒及α颗粒的膜上。进一步分别应用TRPA1的选择性激动剂异硫氰酸丙酯（propyl isothiocyanate,AITC）和等体积PBS预处理血小板。流式细胞术结果显示AITC组的胞内ROS水平和[Ca2+]i显著升高;而细胞膜的MFI显著降低。WB结果显示AITC组的微管蛋白β3浓度显著降低。BAC法蛋白浓度检测结果显示AITC组上清中的蛋白浓度显著升高。这些结果说明4℃冷藏血小板的细胞损伤可能是由TRPA1介导的[Ca2+]i升高并进一步诱导ROS的过量生成引起。3.4℃冷藏血小板的抗MRSA功能研究取适量MRSA菌液,分别加入备用血小板和等体积PBS并混匀,180 r/min,37℃震荡培养12小时。从0小时开始到12小时,每隔30分钟检测培养菌液的光密度（optical density,OD）,并绘制细菌生长曲线。结果显示在0小时至6.5小时之间,血小板组与PBS组的OD值基本相同;而在6.5小时至12小时之间,血小板组的OD值明显低于PBS组。在培养第7小时细菌凃板计数,结果显示血小板组的菌落数显著低于PBS组。以上结果表明,血小板具有抑制MRSA生长的作用。取适量羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFDA SE）标记过的MRSA,分别加入1,1’-二十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基二吲哚菁菁高氯酸盐（1,1’-dioctadecyl-3,3,3‘,3’-tetramethylindodicar-bocyanine perchlorate,DiD Perchlorate）标记过的血小板和等体积PBS并混匀,37℃震荡孵育30分钟,应用流式细胞术检测血小板对MRSA的捕获功能。结果显示,血小板组中被检颗粒的前向角散射（forward scatter,FSC）平均值显著高于PBS组,而CFDA SE的MFI与PBS组无差异,且血小板组中被检颗粒的DiD Perchlorate的MFI显著高于PBS组。该结果说明血小板可以捕获MRSA。取适量备用血小板,分别加入备用MRSA菌液和等体积PBS并混匀,37℃震荡孵育5分钟,ELISA检测PF4浓度。结果显示MRSA与血小板共培养组的PF4浓度显著高于单独的血小板组。该结果提示血小板可能通过分泌PF4发挥抗MRSA作用。上述这些结果表明血小板可能通过捕获粘附和分泌PF4发挥抗MRSA功能。将纯化血小板分别在22℃和4℃保存48小时,然后分别与MRSA共培养,从0小时开始到12小时,每隔30分钟检测菌液OD值,并绘制细菌生长曲线。结果显示在0小时至7.5小时之间,4℃冷藏血小板组的OD值低于22℃保存血小板组;而在7.5小时至12小时之间,两组的OD值基本相同。在培养第6.5小时细菌凃板计数,结果显示4℃冷藏血小板组的菌落数低于22℃保存血小板组。上述结果表明与22℃保存血小板相比,4℃冷藏血小板的抗MRSA作用发挥较早且持续时间相同。4.结论4℃冷藏条件可损伤血小板,其机理可能是通过TRPA1介导[Ca2+]i的升高,进而诱导胞内ROS的过量生成,进一步破坏血小板的微管蛋白β3和细胞膜,并造成内容物外漏。本研究还发现,血小板可能通过捕获及分泌PF4的方法发挥抗MRSA作用,而且与22℃保存血小板相比,4℃冷藏血小板的抗MRSA功效更优。