研究背景和目的胃癌(Gastric cancer,GC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率居全部恶性肿瘤的第四位。2008年全球胃癌患者新发病例约100万例,当年因胃癌死亡的患者大约为73万例,约占全部恶性肿瘤总发病的8%,及总死亡的10%。其中,超过70%的新发胃癌患者和死亡患者出现在发展中国家,主要分布在东欧、南美洲及亚洲地区。即使在过去数十年里,胃癌的诊断和治疗已经取得了巨大的进展,患者的死亡有所改善,但在全世界范围内,其仍然是恶性肿瘤相关死亡的第二大原因。造成这种情况的主要原因是大多数胃癌患者在诊断时已处于胃癌晚期,失去手术根治的机会,得不到有效的治疗。目前,已经报道了几个新的影响胃癌患者预后和/或治疗效果的组织蛋白标志物,然而,仅有少量的蛋白标志物被用于临床实践。因此,发现可精确预测胃癌患者预后或预测治疗效果的新分子标志物,对其进行深入研究,制备出相应的分子靶向药物,对于胃癌患者来说是非常迫切的需要。富含脯氨酸蛋白11(Proline-rich protein 11,PRR11)基因是一个新近鉴定的具有癌基因潜能基因。Ji Ying等于2013年初步研究了其在肺癌中的作用,并揭示其在肺癌细胞周期和肺癌形成中具有关键性的作用,可能在肺癌中作为一个新的潜在的诊断和/或治疗靶点。目前,PRR11基因在胃癌中的表达模式及其对胃癌影响的认识尚未见报道,需要进行研究,可能为胃癌的诊断与治疗提供新的理论思路和临床实践。在这个研究中,我们收集了216例胃癌患者的胃癌组织及其正常胃粘膜组织进行了PRR11蛋白表达状态评估,分析了PRR11蛋白表达与胃癌临床病理参数之间的关系,判断PRR11蛋白表达是否可以预测胃癌患者的预后及其与哪些胃癌临床病例参数相关。在PRR11蛋白高表达的胃癌细胞中沉默PRR11基因后,分析其对胃癌细胞增殖、克隆形成及裸鼠体内移植瘤生长的影响。基因表达谱分析PRR11基因沉默后引起一些基因表达变化显著,筛选表达变化显著的基因做相关性分析。我们筛选出表达显著降低的基因三螺旋重复胶原蛋白1(Collagen triple helix repeat containing 1,CTHRC1)及表达显著增加的基因羧肽酶A抑制因子(Latexin,LXN),免疫组化检测PRR11与CTHRC1及LXN共表达情况,分析PRR11与CTHRC1及LXN表达的相关性。研究方法1.组织样本及患者信息从病理资料库中选择符合以下条件的胃癌患者216例:2001年1月至2005年12月期间,在解放军上海长海医院普通外科进行手术切除治疗的胃癌患者,随访日期至2010年12月。并从组织标本库中挑出HE染色切片及组织蜡块,经病理科两位经验丰富的病例专家独立确定为胃癌。胃癌患者临床病理参数包括年龄、性别、肿瘤大小、T分期、N分期、TNM分期及肿瘤分化程度。本研究所有组织样本的获得,均得到患者的同意,并签订知情同意书,并得到长海医院伦理委员会许可。2.组织芯片(Tissue microarray,TMA)及免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)由两位经验丰富的病理学专业人员对所有患者的HE染色组织玻片均进行了会诊及鉴定,确定为胃癌组织,并在具有代表性的部位进行标记。从每个供体蜡块上打孔取出直径为1.5mm的组织柱,放入受体石蜡中。4um厚的切片被放到包被3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane,APTS)的玻片上。抗体稀释如下:抗-PRR11(1:100稀释),抗-LXN(1:100稀释);抗-CTHRC1(1:100稀释)。链霉亲和素—过氧化物酶法(Streptavidin-perosidase,S-P法)免疫组化染色使抗体结合组织显色,苏木素复染。PRR11、LXN、CTHRC1免疫组化染色由两个独立的专家在奥林帕斯CX31显微镜下观察。肿瘤细胞PRR11蛋白染色(胞浆呈棕色)数量>10%即为阳性。3.细胞系及培养条件在5个GC细胞系(SGC7901,MKN45,MKN28,HGC27,MGC803)中发现PRR11蛋白均有表达。GC细胞系培养于杜尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco modified Eagle medium,DMEM)加上10%的胎牛血清(Fetal calf serum,FBS)中,并置于37℃,含5%CO2的培养箱中培养,细胞覆盖率达80%左右传代培养。4.通过载有sh RNA的慢病毒敲低胃癌细胞中的PRR11蛋白表达包含靶向PRR11的短发夹RNA(Short hairpin RNA,sh RNA)(5’-ACG CAG GCC UUA AGG AGA ATT-3’)的慢病毒由GENECHEM公司构建,含6ug/ml聚凝胺,用来转染胃癌细胞。转染后的胃癌细胞用嘌呤霉素进行选择,利用蛋白质免疫印迹(Immunoblotting,Western blot)方法检测PRR11敲低的效果。5.细胞增殖分析和克隆形式分析以每孔5000个细胞的密度,将稳定转染的PRR11-sh RNA细胞(PRR11-KO细胞)或空载体阴性对照细胞(PRR11-NC细胞)接种于96孔板中,各设三个副孔,利用细胞计数盒(Cell counting Kit-8,CCK8),通过计算24小时及48小时的吸光度,检测细胞增殖率。同上,以每孔500个细胞的密度,将PRR11-KO细胞和PRR11-NC细胞接种于6孔板中,各三孔。孵育两周后,甲醇/丙酮(1:1)固定,结晶紫染色,计算超过50个细胞的克隆数量。6. Western blot分别准备5种胃癌细胞系总蛋白,利用兔抗人PRR11、CTHRC1、LNX的多克隆抗体(1:1000稀释),及辣根过氧化物酶(Horse radish peroxidase,HRP)结合的山羊抗兔Ig G抗体(1:10000稀释)作为二抗,β-actin作为内参。根据生产厂家的说明,利用Amersham增强化学发光系统进行蛋白显影及灰度值检测。7.实时定量逆转录PCR(q RT-PCR)分析根据说明,利用SYBR1 Premix Ex Taq TM试剂盒进行实时定量逆转录聚合酶链式反应(Quantitative Real-time reverse transcription PCR,q RT-PCR),甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作为内参。PCR程序为95℃1分钟,然后在95℃15秒,60℃31秒,共40个循环。利用ΔCt方法计算倍增表达。利用ABI PRISM 7300系统进行PCR检测及分析。引物利用如下:PRR11:前5’-CGT ATC TGC CAC CGA GAA CTT-3’,反:5’-GAG ATG GTC TTC AGT GCT TCC T-3’;GAPDH:前5’-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3’,反:5’-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-3。8.动物模型通过裸鼠皮下细胞移植瘤模型评估PRR11敲低后的SGC7901细胞即PRR11-KO细胞体内成瘤及生长能力变化。PRR11-KO细胞和PRR11-NC细胞(1×106个细胞0.1ml PBS)分别注射于4周龄雌性Balb/c裸鼠右侧腋下。每三天测量肿瘤直径。移植后2周,处死所有裸鼠。收集肿瘤并测量肿瘤体积,V=0.52(长×宽×高)。9.统计分析统计分析利用SPSS 13.0软件。PRR11蛋白表达和胃癌临床病理参数之间的关系分析采用χ2检验(chi-squared分布)。根据PRR11蛋白表达情况对胃癌患者分层,利用Kaplan-Meier方法进行生存分析。单因素和多因素分析基于Cox比例风险回归模型。实验计量资料以平均值±标准差的方式呈现,计量资料分析采用Student’t-检验。p﹤0.05认为有统计学意义。研究结果1.胃癌组织及正常胃粘膜组织中PRR11蛋白表达差异显著,PRR11蛋白表达与胃癌临床病理参数相关我们对216例确诊为胃癌的患者样本进行免疫组化评估。结果显示PRR11蛋白在正常胃粘膜组织中的免疫染色为低强度,而在部分胃癌组织中的免疫染色为高强度。在216例胃癌组织样本中有107例(49.5%)PRR11蛋白表达阳性,109例(50.5%)PRR11蛋白表达阴性。q RT-PCR及Western blot分析进一步证明,相对于相应的正常胃粘膜组织,PRR11 m RNA及蛋白在胃癌组织样本中高表达。另外在SGC7901,MKN45,MKN28,HGC27和MGC803等5个胃癌细胞系中,我们发现PRR11蛋白均有表达。PRR11蛋白表达水平与多个胃癌临床病理参数之间关系的分析显示:PRR11蛋白表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、N分期无明显相关性,而与T分期、肿瘤分化程度、TNM分期显著相关。该结果提示PRR11蛋白高表达可能与胃癌的侵袭及转移相关。2.PRR11表达上调和胃癌患者生存降低相关216位胃癌患者中,122例在随访期间死亡,中位生存期(Median survival time,MST)为51.5个月。PRR11蛋白表达阴性的胃癌患者中位生存期为74.5个月,而PRR11蛋白表达阳性的胃癌患者中位生存期为46.4个月。另外,单变量COX回归分析显示肿瘤大小、肿瘤T分期、区域淋巴结转移、TNM分期、肿瘤分化程度及PRR11表达与患者总生存(Overall survival,OS)显著相关。多变量分析显示肿瘤大小、肿瘤分化程度、PRR11表达是胃癌患者独立的预后因素。把患者分成I/II期和III/IV期两个亚群,分析PRR11表达对各亚群患者生存时间的影响,结果显示在I/II期与III/IV期两个亚群中,相对于PRR11不表达患者,PRR11高表达患者预后较差(P<0.05)。3.PRR11低表达与SGC7901胃癌细胞体外增殖、克隆形成减少以及体内肿瘤生长缓慢相关利用慢病毒载荷PRR11 sh RNA稳定沉默SGC7901细胞系中PRR11表达。Western blot方法检测确证PRR11低表达SGC7901细胞系(PRR11-KO)成功建立,PRR11-KO细胞中PRR11表达显著降低,PRR11低表达与SGC7901细胞系体外增殖及克隆形成明显下降相关。同样,PRR11表达下调导致SGC7901细胞系裸鼠体内生长延缓。4.PRR11表达敲低后导致CTHRC1表达下调及LXN表达上调我们利用基因表达谱进行差异表达分析发现,PRR11表达下降导致CTHRC1m RNA表达下调及LXN m RNA表达上调。进一步利用CTHRC1蛋白和LXN蛋白抗体进行了Western blot分析,来探索这些蛋白是否随着PRR11表达降低而改变。结果显示:与PRR11-NC细胞相比较,在PRR11-KO细胞中CTHRC1蛋白表达下调,LXN蛋白表达上调。通过胃癌组织免疫组化检测进行共表达分析。数据显示胃癌组织中CTHRC1蛋白表达与PRR11蛋白表达正相关(r=0.299,p<0.001),LNX蛋白表达和PRR11蛋白表达负相关(r=-0.188,p=0.005)。而CTHRC1蛋白表达和LXN蛋白表达无相关性(r=-0.042,p=0.539)。结论1.PRR11蛋白在胃癌组织中高表达,在正常胃粘膜组织中低表达,且与胃癌分化程度、T分期、TNM分期等临床病理参数相关。这提示PRR11蛋白高表达可能与胃癌细胞的侵袭与转移相关。2.多因素分析显示胃癌肿块大小、分化程度与PRR11蛋白表达是胃癌患者总生存的独立预后因素。3.PRR11蛋白在胃癌细胞系中表达,PRR11蛋白低表达降低了胃癌细胞体外增殖、克隆形成能力及体内肿瘤生长能力。4.PRR11表达敲低后引起胃癌细胞中CTHRC1表达下调以及LXN表达上调。5.进一步研究PRR11蛋白对胃癌发生、发展的作用机制,可为临床防治胃癌提供新的作用靶点。