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背景角膜上皮细胞层是眼球抵御外界有害致病因素侵犯的第一道屏障,在受到创伤后可以快速修复愈合,当愈合延迟时,会造成视力下降,严重时导致失明。目前部分临床及动物实验报道角膜上皮本身存在一定的自我更新及修复能力,但角膜损伤后发挥主要作用的并非角膜上皮而是来自于角膜缘的细胞组织,该组织中含有角膜缘干细胞(LSC),角膜缘干细胞可以通过细胞增殖、分化及迁移来修复损伤的角膜组织。有报道称角膜缘干细胞缺失时角膜的修复功能会受到限制,且角膜修复功能还与角膜结膜化、新生血管生成、慢性炎症刺激及持续性的角膜上皮损害等因素有密切关系,在上述因素等持续存在,角膜最终不能够修复时可产生严重的后果即失明,同时研究表明,我们可通过移植角膜缘组织及角膜缘干细胞进行角膜损伤的治疗,这提示了角膜缘干细胞组织在创伤角膜修复过程中发挥着重要作用。在角膜损伤后,角膜缘干细胞即开始增殖,并分化为过渡性细胞,这种细胞可迁移至损伤部位,诱导细胞表达角膜上皮细胞标记进而促进角膜损伤的修复。然而角膜上皮细胞与角膜缘干细胞组织之间相互作用的分子通路及机制目前尚不清楚。Jia等报道角膜机械或化学损伤后细胞中负责生长及分化的因子基因表达明显增强,包括转化生长因子α (TGF-α)、转化生长因子β (TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、肝素样生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子β (FGF-β)等,这些因子均可由角膜上皮细胞生成,它们参与调节细胞的增殖与生长。此外,胰岛素样生长因子2(IGF-2)也被证实能够促使角蛋白细胞增殖,并使黏附连接蛋白N钙黏附素的生成增加,.使细胞外基质增加,从而促使角蛋白胶原的生成。胰岛素样生长因子信号通路已被证实与细胞增殖及分化相关,在细胞及器官水平的生长调节中起重要作用,IGF及以上所述其他细胞调节因子与角膜缘干细胞的增殖、分化及迁移的发生有关。胰岛素样生长因子家族(IGFs))是由两种低分子多肽(IGF-1、IGF-2)、两类特异性受体及六种结合蛋白组成。人体内许多组织都可以合成、分泌胰岛素样生长因子,但循环中的IGF则主要是由肝脏分泌的。胰岛素样生长因子家族的生物学功能是通过与特异性的靶细胞表面的胰岛素样生长因子受体结合而实现的。已发现有两种结构完全不同的IGF受体：IGF-1受体和IGF-2受体(即甘露糖-6磷酸受体)分别又称1型受体和2型受体。正常情况下,IGF与其结合蛋白的亲和力大于或近似等于与其受体的结合,加之高亲和力受体低表达,使少量游离IGF与大量IGF/IGFBP复合物处于平衡状态。IGFs的合成与分泌受血液中生长激素水平的控制,循环中IGFs对生长激素的分泌具有负反馈调节作用,从而形成了一个生长激素—胰岛素样生长因子轴,其对机体组织的分化、增殖及物质代谢具有重要的调节作用。以往研究表明,借助角膜上皮细胞表面的细胞表型标记细胞角蛋白K3及K12或连接蛋白43可对角膜缘干细胞与角膜上皮细胞进行区分,并且此类因子与角膜缘干细胞的增殖及分化亦相关,且还有研究报道说,角膜上皮细胞培养液的上层部分可促使多种干细胞包括毛囊干细胞、间充质干细胞及胚胎干细胞等,分化为携带角膜上皮细胞标记K12的细胞,但相关的分子机制仍不清楚。目的角膜创伤修复的过程通常包括细胞的激活、增殖、分化,细胞因子的释放,细胞外基质的合成与重塑等,都是由多种细胞因子在时间和空间上高度协调而完成的。明确角膜损伤修复过程中关键的调控分子及其作用机制,对于角膜损伤后减少瘢痕形成、促进角膜愈合具有重要意义。本研究中我们利用小鼠角膜机械损伤模型对损伤后角膜上皮细胞与角膜缘干细胞间的相互作用分子机制进行初步探究。方法构建小鼠单侧眼角膜机械损伤模型,对侧角膜为对照组,不同时间点采集小鼠双侧角膜中央及角膜缘组织,进行细胞培养并基因检测EGF、FGF-b、KGF、HGF、TGF-b1、IGF-1及IGF-2等细胞因子不同程度的反应性改变,探究这些细胞因子对角膜缘干细胞分化及成纤维细胞转化的影响,并探讨mTOR/STAT3信号通路在IGF-2调控角膜上皮细胞增殖分化过程中的作用。结果1.角膜上皮损伤后,小鼠眨眼加剧,有畏光的现象,角膜上有不规则的斑块状结构；对损伤角膜组织行苏木精-伊红(HE)染色后显示,针尖破坏角膜上皮层,而基质层未受损,提示我们所采用的角膜机械损伤模型方法可行性良好。2.中央角膜损伤后(0、3、6、12及24h)采集受损侧小鼠角膜组织,实时PCR检测相关细胞因子的基因表达,损伤后3h及6h EGF、FGF-b、KGF、HGF、TGF-b1、IGF-1及IGF-2的基因表达水平升高,IGF-2因子的水平损伤后3h最高,并且显著高于其他各种检测的细胞因子(p<0.05)3.角膜损伤后角膜缘干细胞组织较角膜上皮细胞中两种受体的基因表达水平显著增加,3h后其表达差异均具有统计学意义(p<0.05)。4.IGF-2对角膜上皮细胞的增殖有促进作用,并且随着培养时间延长,IGF-2干预组的增殖能力与对照组比较有明显的区别。从24h开始,IGF-2干预组的角膜上皮细胞迁移能力明显高于对照组,48h更为明显。通过对细胞骨架进行染色观察,发现IGF-2组较对照组有更强的粘附率。5.胰岛素样生长因子2(IGF-2)在角膜损伤后迅速大量表达,同时促使角膜缘细胞IGF2受体的表达增加并诱导角膜缘干细胞分化为带有K12标记的角膜上皮细胞。6.免疫荧光染色分析显示受损角膜组织细胞中α-平滑肌肌动蛋白水平显著增加,提示可能存在成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化。7.检测磷酸化mTOR与磷酸化STAT3蛋白表达的变化,发现p-mTOR与p-STAT3蛋白的表达均随IGF-2浓度的增加而增多。8.使用IGF-2后,检测EGF、FGF-b、KGF、HGF及TGF-bl等细胞因子损伤相关蛋白的表达变化,发现这几个细胞因子在受到IGF-2刺激后,其蛋白表达水平均较对照组有显著的升高,但当同时再给予mTOR/STAT3信号通路抑制剂RAPA50 μmol/L后,发现上述几个细胞因子的蛋白表达被明显抑制。结论1.小鼠单侧眼角膜机械损伤模型具有可重复性,角膜上皮能完全修复,模型制作成功,可用于对角膜上皮损伤修复过程的研究。2.角膜机械损伤后角膜上皮中IGF-2因子表达明显上调,角膜缘组织中IGF-2受体表达增加,其共同作用促使角膜缘干细胞向角膜上皮细胞转化,同时在成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化中起一定的作用,对角膜损伤修复有促进作用。3.在体外培养状态下,特异性的阻断mTOR/STAT3信号通路可以阻断IGF-2对角膜上皮细胞的修复作用,IGF-2对角膜上皮细胞修复的这种效应可能是通过激活mTOR/STAT3信号通路而发挥作用。