目前临床治疗癌症的常用方式包括手术治疗、放射治疗及化学疗法,但这三种方法对于治疗晚期癌症仍收效甚微,因此寻求新的治疗手段迫在眉睫。鉴于嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞在血液瘤治疗上获得了显著的临床疗效,近年来将这一技术应用于实体瘤治疗已逐渐成为研究热点。然而由于肿瘤免疫抑制微环境等多种因素的影响,导致CAR-T细胞在治疗实体瘤过程中的疗效受到限制,因此大量研究致力于对CAR各个结构进行优化,以有效提高CAR-T细胞的抗肿瘤功效。T细胞的活化需要多种信号的参与,包括抗原激活信号(第一信号)、共刺激分子信号(第二信号)及细胞因子信号(第三信号),但是目前临床使用的CAR-T胞内结构中普遍缺乏细胞因子提供的第三信号,同时在肿瘤微环境中大多为TGF-β、IL-10等抑制信号,因此CAR结构的优化方向之一逐渐集中于为CAR-T细胞提供额外的激活性细胞因子信号。IL-12作为一种Th1型细胞因子,是T细胞活化、分化过程中经典的激活性第三信号,被认为是机体抵抗肿瘤发生、发展的重要效应分子,已逐步尝试应用于CAR-T细胞治疗。目前已经构建能在局部释放IL-12的CAR-T细胞,然而由于IL-12分泌水平无法控制,在临床研究中发现此类CAR-T细胞具有潜在的毒性,因此需要进一步优化CAR结构以增强安全性。由于IL-12的生物学功能主要通过IL-12R介导,且IL-12Rβ1亚基和IL-12Rβ2亚基均与T细胞的分化过程密切相关,因此为了使细胞因子分泌导致的毒性与其介导的抗肿瘤作用分离,同时提供激活性第三信号以克服肿瘤微环境的抑制作用。本课题尝试在现有2代CAR结构基础上整合IL-12Rβ1或IL-12Rβ2胞内段,使CAR仅在抗原特异性激活的同时触发包括TCR(通过CD3ζ结构域),共刺激(通过4-1BB结构域)和细胞因子(通过IL-12R结构域)在内的三个协同刺激信号,旨在确定仅在抗原参与时才传导的IL-12信号是否可以增强CAR-T细胞的抗肿瘤作用,以期在肿瘤局部免疫抑制因素存在的情况下能提高T细胞的抗肿瘤活性,同时保证其使用的安全性。为体现细胞因子信号对于CAR-T细胞治疗实体瘤的有效性,我们以免疫抑制性较强的前列腺癌为目标,选择目前临床上最广泛采用的含有共刺激信号4-1BB的CAR-T载体作为主体框架,分别构建了靶向前列腺癌抗原PSMA和靶向CD19的含有IL12Rβ1或IL12Rβ2胞内段的新型PSMA-CAR-T和CD19-CAR-T细胞,并对其表型和功能进行系统的体外评价。本课题的研究表明:经抗原刺激后,与仅含有共刺激信号4-1BB结构域的CAR-T细胞相比,整合IL12Rβ1或IL12Rβ2胞内段能在不影响CAR-T细胞增殖的情况下,提高T细胞的活化水平,促进STAT4蛋白磷酸化及CD69、CD25蛋白的表达水平,为CAR-T细胞传递IL-12激活信号;同时鉴于IL-12对T细胞分化产生的影响,本课题还检测了整合IL12Rβ1或IL12Rβ2胞内段对T细胞分化为不同细胞亚群的影响,结果显示,整合IL-12R胞内段尤其是IL12Rβ2胞内段能显著提高CD45RO~+记忆性T细胞的比例,但对CD4~+/CD8~+T细胞的比例及CAR-T细胞耗竭无明显影响;基于上述结果,本课题评估了整合IL12Rβ1或IL12Rβ2胞内段对CAR-T细胞免疫功能的影响,结果显示,整合IL12Rβ1或IL12Rβ2胞内段能显著促进CAR-T细胞分泌细胞因子TNF-α、IFN-γ,促使CAR-T细胞更快地发挥抗肿瘤功效,同时在抗原多次刺激下,IL-12激活信号的持续活化能使含有IL12Rβ1或IL12Rβ2胞内段的CAR-T细胞具有更强的杀伤优势,尤其是整合IL-12Rβ2胞内段的CAR-T细胞无论在细胞因子的释放程度还是抗肿瘤作用中相对于整合IL-12Rβ1胞内段都有更优异的表现。综上所述,本课题验证了通过整合细胞因子受体胞内段能以抗原依赖的方式为CAR-T细胞传递IL-12激活信号,首次证明了整合IL-12R胞内段尤其是IL-12Rβ2胞内段能有效提高CAR-T细胞的体外抗肿瘤能力,为利用细胞因子受体胞内段进行CAR结构优化的可行性提供了体外实验证明,对进一步利用细胞因子激活信号解决CAR-T细胞在实体瘤免疫抑制性微环境中遇到的问题有重要意义。