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目的:类胰岛素生长因子-Ⅰ(insulin-like growth factors,IGF-Ⅰ)被认为是牛乳中发挥其生理功效的主要因子之一,它是生长激素产生生理作用过程中必需的一种活性蛋白多肽物质,能够通过促进有丝分裂,抑制细胞凋亡和提高趋化活性等机制,刺激人体各组织器官的形成和发展。但也有研究表明,机体内高水平的IGF-Ⅰ能够增加人群患乳腺癌、前列腺癌和直肠癌等疾病的风险。IGF-Ⅰ通过促进细胞增殖和凋亡、血管生成和转移,从而对癌症发展和行为的每个关键的阶段产生影响。因此乳制品中过量添加IGF-Ⅰ,可能会对广大消费者,尤其是对处于癌症风险中人群身体健康造成影响。目前国内外关于IGF-Ⅰ的食品安全卫生标准尚未见报道,并且缺少乳及乳制品中IGF-Ⅰ的标准检测方法以及含量水平资料。本研究建立一种能够及时、准确、可靠地检测乳及乳制品中IGF-Ⅰ的快速检测方法,为评价乳及乳制品中IGF-Ⅰ饮食安全,制定食品中IGF-Ⅰ的卫生标准提供科学依据。
方法:通过酸醇溶液处理乳及乳制品,利用兔抗人IGF-Ⅰ抗体、生物素标记的抗人IGF-Ⅰ抗体、亲和素-过氧化物酶复合物等建立ELISA试剂盒,并根据实验原理和潜在的影响因素,选取向微孔中加入标准品和样品后的第1次温育时间、第2次温育时间、显色剂加入量和显色时间等4个影响因素进行单因素试验,确定最佳操作程序、建立ELISA试剂盒的标准曲线,并对其准确度和精密度进行评价。将建立的ELISA试剂盒与高效液相色谱法进行比较,评价两者的一致性。
结果:通过试验确定包被抗体的最佳稀释度为1:3200、生物素标记的兔抗人IGF-Ⅰ抗体最佳稀释度为1:100、亲和素-过氧化物酶复合物最佳稀释度为1:100、第一次温育时间40min、第二次温育时间40min、显色剂加入量50μL和显色时间15min。按照以上操作程序,建立该方法的标准曲线为y=0.0002x+0.0094(P<0.009),R2=0.9943。平均回收率为92.5%(87.9-98.9%),变异系数为5.6到7.8%。通过重复性试验,组内变异为3.9到4.5%,组间变异为6.6到7.8%。通过线性回归分析,ELISA与高效液相色谱法有较好的一致性。
结论:本研究建立的乳及乳制品IGF-ⅠELISA检测方法较好的准确度、灵敏度和稳定性,并且与HPLC有较高的一致性,能够及时、准确、可靠地对乳及乳制品中的IGF-Ⅰ进行分析、监测。