【摘 要】
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人类基因组计划的完成,标志着基因组测序研究在生命科学领域中越来越重要,挖掘功能基因的作用,揭示基因与疾病之间的联系。5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5m C)是DNA甲基化中最常见的一种,在哺乳动物中,大约占胞嘧啶总量的3-8%[1]。在ten-eleven translocation(Tet)蛋白的作用下,5-甲基胞嘧啶会被逐步氧化成5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymeth
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人类基因组计划的完成,标志着基因组测序研究在生命科学领域中越来越重要,挖掘功能基因的作用,揭示基因与疾病之间的联系。5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5m C)是DNA甲基化中最常见的一种,在哺乳动物中,大约占胞嘧啶总量的3-8%[1]。在ten-eleven translocation(Tet)蛋白的作用下,5-甲基胞嘧啶会被逐步氧化成5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hm C)、5-醛基胞嘧啶(5-formylcytosine,5f C)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxycytosine,5ca C)。为了深入了解每一个胞嘧啶甲基化修饰的生物学功能和意义,在全基因组上对胞嘧啶修饰的分布进行分析非常必要。这些修饰具有表观遗传调控的重要功能,为了深入研究这些修饰的生物学功能,需要精准的阐明其在基因组上的确切位置,获得它们的单碱基分辨率的定位信息。载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样基因(Apolipoprotein B mRNA editing enzyme,catalytic polypeptide-like,简称APOBEC)家族蛋白具有胞嘧啶的脱氨活性,近年来研究发现APOBEC3A蛋白除了能够对DNA上的C和5m C进行脱氨基外,对于5m C的氧化衍生物产物也具有一定的脱氨基活性。基于此,我们利用APOBEC3A蛋白的脱氨基活性,研究了APOBEC3A蛋白对C、5m C、5hm C、5f C和5ca C的脱氨活性,分别建立了DNA中5hm C和5ca C单碱基分辨率定位分析方法。具体内容如下:1、脱氨酶介导5hm C单碱基定位分析重组表达了APOBEC3A蛋白,利用限制性内切酶方法和高效液相色谱串联质谱鉴定APOBEC3A蛋白的活性。APOBEC3A可以轻易地对C、5m C和5hm C进行脱氨基,使其转化为相应的尿嘧啶(uracil,U)、胸腺嘧啶(thymine,T)和5-羟甲基尿嘧啶(5-hydroxymethyluracil,5hm U)。为了要检测DNA上的5hm C,我们利用T4噬菌体β葡糖基转移酶对DNA上5hm C进行标记,标记后的5hm C可以很好的抵御APOBEC3A的脱氨基作用。经过PCR扩增后,在测序过程中,原来的DNA模板上的C和5m C被读作T,而被保护的5hm C被读作C。结合二代测序可以得到基因组DNA上5hm C单碱基定位信息。2、脱氨酶介导5ca C单碱基定位分析方法通过酶促反应动力学考察了APOBEC3A蛋白对C、5m C、5hm C、5f C和5ca C的反应速率研究APOBEC3A对C、5m C、5hm C、5f C以及5ca C的脱氨基活性后,我们发现,APOBEC3A对5ca C几乎没有任何的脱氨活性,基于此,我们直接利用APOBEC3A对DNA进行处理,C、5m C、5hm C和5f C都会被APOBEC3A蛋白脱氨基形成相应的脱氨产物,经过PCR扩增后,在测序过程中,C、5m C、5hm C以及5f C都被读作成T,只有5ca C被读作为C。通过对基因组DNA中5ca C的富集,再结合二代测序就可以快速简便的获得5ca C的单碱基定位信息。总的来说,本论文利用APOBEC3A蛋白对不同胞嘧啶修饰的活性,分别建立了针对5hm C和5ca C的单碱基定位分析方法,研究工作为深入探索5hm C和5ca C的生理功能提供了基础。
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