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本文主要从以下三个部分展开论述: 第一部分 针刺法建立SD大鼠椎间盘退变动物模型 目的:针刺SD大鼠椎间盘,建立SD大鼠椎间盘退变动物模型并为下一步实验提供动物模型。方法:SD大鼠68只,选用27G穿刺针,针刺L23、L34、L45、L56椎间盘,C臂机正侧位透视确认针尖均位于椎间盘中央。针刺前及针刺后第2、第4周随机选取15只SD大鼠对针刺退变的椎间盘统一行核磁共振检查。结果:MRI示:术后2周到术后4周,针刺后椎间盘的T2W1信号持续减弱,椎间盘高度持续下降,硬脊膜受压,各组间Pfirrmann分级结果差异有统计学意义(P<0.05)。结论:针刺法可诱导椎间盘退变,建立椎间盘退变模型,并随着时间的延长,椎间盘退变程度加重。 第二部分 骨髓间充质干细胞的体外培养、鉴定及荧光标记 目的:贴壁筛选法体外培养及扩增骨髓间充质干细胞(BMSCs),并对BMSCs进行鉴定及荧光标记,为下一步实验提供种子细胞。方法:用PBS缓冲液反复冲洗SD大鼠股骨、胫骨骨髓腔至干净的培养皿内,用含FBS的DMEM/FI2培养基进行体外培养,扩增。显微镜下观察各代BMSCs生长状态,流式细胞仪鉴定细胞表面标记物CD90、CD29、CD44和CD34,并用含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的腺病毒转染使其带有EGFP基因,作荧光标记。结果:贴壁筛选法成功培养出BMSCs,且细胞生长旺盛,传到第三代活力最强,免疫表型鉴定结果CD29、CD90、CD44阳性而CD34阴性,经EGFP腺病毒转染后能发出绿色荧光。结论:分离培养的细胞生长旺盛并符合BMSCs细胞表型,经EGFP腺病毒转染后带有绿色荧光,能作为荧光标记,为下一步实验的进行提供种子细胞及细胞标记。 第三部分 bFGF和TGF-β1复合骨髓间充质干细胞对大鼠退变椎间盘的修复作用 目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子(TGF-β1)复合骨髓间充质干细胞(BMSCs)以温敏性壳聚糖(TCH)为载体对大鼠退变椎间盘的修复作用。方法:将针刺椎间盘退变4周后的SD大鼠分成四组,实验组A组使用bFGF、TGF-β1+BMSCs+TCH凝胶移植入退变的椎间盘中,B组和C组分别使用BMSCs+TCH凝胶和bFGF、TGF-β1+TCH凝胶,对照组D组使用PBS缓冲液。继续饲养4周后核磁共振观察各组椎间盘的修复情况。HE、Masson染色,组织病理学观察各组椎间盘结构。RT-PCR,Western-blot检测各组髓核蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)、Sox-9、Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)的表达。结果:移植注射的BMSCs能在椎间盘中生长,呈类髓核分化。核磁共振结果显示:A组髓核信号明显高于其他三组,B组高于C组,D组髓核信号最低,硬脊膜受压,脊髓呈串珠状改变,各组间Pfirrmann分级结果差异有统计学意义(P<0.05)。HE,Masson染色示:A组椎间盘结构完整,髓核细胞数量优于其他三组,髓核和纤维环界限清楚,B组髓核数量多于C组,B组纤维环未见断裂,而C组可见断裂的纤维环,D组髓核细胞被杂乱的纤维组织取代。RT-PCR,Western-blot示:A组Aggrecan、CollagenⅡ、Sox-9的表达最高,B组优于C组,D组表达最低。而CollagenⅠ的表达,四组之间未见明显差异。结论:移植的BMSCs在退变椎间盘中能够存活,呈类髓核分化。bFGF、TGF-β1+BMSCs+TCH凝胶复合体对退变的椎间盘具有明显修复作用。BMSCs+TCH凝胶治疗退变椎间盘的效果优于bFGF、TGF-β1+TCH凝胶但低于bFGF、TGF-β1+BMSCs+TCH凝胶复合体。