克氏原螯虾(Procambarus clarkii),隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、原螯虾属(Procambarus),是我国重要的淡水经济虾类,亦被作为甲壳动物研究领域的模式生物。近年来,因其肉味鲜美广受国内外人们的欢迎,克氏原螯虾养殖产量随之也逐年攀升。然而,随着人工养殖面积持续扩大,白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)等病原菌给克氏原螯虾养殖业带来了重大经济损失。因此,对克氏原螯虾抗病毒机制及抗病克氏原螯虾品系培育的研究十分有必要。本研究在前期对克氏原螯虾转录组分析的基础之上,聚焦于可能在克氏原螯虾抗WSSV过程中发挥了重要功能的2个基因:碳水化合物磺基转移酶11(Carbohydrate sulfotransferase11,Chst11)和酚氧化酶原(prophenoloxidase,proPO),对proPO和Chst11基因在抗WSSV过程中的作用进行了研究,并在proPO基因上成功筛选到克氏原螯虾抗WSSV相关的SNP位点,研究结果可为甲壳动物抗病毒机制提供理论基础,为抗病毒克氏原螯虾培育提供理论技术指导。主要研究内容与结果如下:1.克氏原螯虾Chst11基因的克隆及表达分析Chst11的c DNA全长为1536 bp,其ORF长为831 bp(编码276个氨基酸),预测的分子量为33.1 k Da。Chst11包含一个Sulfotransfer＿2结构域,1个N型糖基化位点和3个O型糖基化位点。系统发育分析结果表明,Chst11与南美白对虾的相似性最高(79.93%)。Chst11在不同组织中的表达分析表明,Chst11在肠、鳃和皮肤中表达最高,在输精管、围食道神经和血淋巴中表达最低。当克氏原螯虾受到WSSV刺激,Chst11在肝胰腺、鳃、胃、肌肉和肠有显著性上调表达;在嗜水气单胞菌刺激下时,Chst11在肝胰腺、鳃、皮肤、胃、肌肉和肠中均有显著性上调表达;在CPG ODN刺激下时,Chst11在肝胰腺、鳃、皮肤和肌肉有显著性上调表达,说明克氏原螯虾受到不同刺激时,Chst11的表达模式不同。2.克氏原螯虾Chst11重组蛋白在克氏原螯虾抗WSSV过程中的作用注射后6和12 h,重组Chst11+WSSV组在肝胰腺中WSSV拷贝数比注射牛血清白蛋白(BSA)+WSSV的对照组相比显著降低。对3个免疫基因的定量分析结果显示,注射Chst11重组蛋白组的克氏原螯虾显著提高了肝胰腺和中肠中peroxinectin,proPO及血淋巴、肝胰腺和中肠中ctl的表达量。在注射后10 d,注射Chst11重组蛋白+WSSV的克氏原螯虾组的死亡率比注射BSA+WSSV的对照组要低60%。3.proPO重组蛋白在克氏原螯虾抗WSSV过程中的作用研究将表达和纯化的proPO重组蛋白+WSSV注射到克氏原螯虾体内后,检测了WSSV在克氏原螯虾肝胰腺和鳃组织中复制的情况,结果表明proPO重组蛋白+WSSV组的WSSV拷贝数显著低于对照组;向克氏原螯虾注射proPO重组蛋白和WSSV后,发现proPO重组蛋白加强了proPO和peroxinectin在肝胰腺和中肠中的表达以及加强了ctl在血淋巴和肝胰腺中的表达。分别统计了proPO重组蛋白+WSSV组、WSSV组、BSA+WSSV组和PBS组10 d内的死亡率,结果表明proPO重组蛋白注射组在注射后第10 d克氏原螯虾的死亡率比BSA+WSSV注射组克氏原螯虾的死亡率低65%。4.克氏原螯虾proPO基因抗WSSV相关SNP标记筛选proPO基因DNA全长为9085 bp,包含5个外显子和4个内含子以及82 bp 5’侧翼区和一个1671 bp 3’非翻译区。在第一和第三内含子区预测到3个TATA框,在第一和第四内含子区分别预测到1段重复序列。在获得proPO基因DNA全长的基础上,利用直接测序法在189个克氏原螯虾中筛选到3个SNP位点并成功分型,这3个SNP位点均位于proPO基因的内含子区中。将这3个SNP位点与克氏原螯虾抗WSSV性状进行关联分析,发现3个SNP位点的TT型在抗性组中均多于敏感组,但只有SNP 7081T>C的基因型在抗性组和敏感组中存在显著性差异(P<0.05)。这些结果表明SNP 7081T>C和克氏原螯虾抗WSSV性状显著相关,推测TT基因型在抗WSSV过程中有积极作用。