【背景和目的】乙型肝炎病毒是非直接致细胞病变、嗜肝性DNA病毒,可引起多种肝脏疾病。全世界慢性HBV感染者约有4亿人,每年有超过100万人死于HBV感染的相关疾病。目前一致认为,机体细胞免疫应答的程度,特别是细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic Tlymphocytes,CTL）的功能,直接影响着感染的转归。慢性HBV感染者特异CTL细胞功能下降与调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）和黏附细胞（adherent cell,AC）有密切的关系,Treg是一类具有免疫抑制作用的T细胞亚群,在慢性感染性疾病中起着重要的免疫抑制作用。AC主要是一类具有抗原提呈作用的细胞,慢性HBV感染者伴有AC抗原提呈功能下降。目前认为Treg可能抑制了HBV特异CTL细胞的功能,但具体机制仍不清楚,因此探明慢性HBV感染者特异CTL细胞免疫调控机制,对于乙肝的治疗起着关键作用。本实验利用AC贴壁生长的特性及磁性细胞分离技术（Magnetic Activated Cell Sorting,MACs）,建立Treg、AC、CTL细胞相互作用的模型,以主要组织相容性复合物一抗原肽四聚体（MHC-肽四聚体,Tetramer）流式细胞技术为核心的HBV特异CTL实验技术为基础,通过体外诱导刺激,探讨慢性HBV感染者Treg、AC对HBV特异CTL细胞体外增殖的影响,为重新恢复HBV特异CTL细胞的功能,打破HBV感染免疫耐受状态,提供新的理论支持,并为寻求新的抗病毒治疗策略提供启发和借鉴。【对象和方法】1.研究对象筛选2008年2月～2008年12月在浙江大学附属第一医院感染科门诊和住院HLA-A2阳性的慢性HBV感染者56例（因针对HBV核心抗原18-27表位的特异性CTL反应是受HLA-Ⅰ类分子限制的,所以筛选HLA-A2阳性病人作为研究对象）,诊断符合2005年12月由中华医学会肝病学分会和中华医学会感染病学分会联合制订的《慢性乙型肝炎防治指南》,同时以10例HLA-A2阳性的正常健康人为对照组,结合临床资料分为A、B、C三组,具体分组情况如下:A组:慢性乙型肝炎患者,共31例,男23例,女8例,年龄19～65岁,平均年龄42.8±11.9岁。其中16例用于细胞刺激培养方法的建立,余15例用于细胞相互作用模型的建立。B组:慢性无症状HBV携带者,共25例,男17例,女8例,年龄16～50岁,平均年龄40.6±9.4岁。其中13例用于细胞刺激培养方法的建立,余12例用于细胞相互作用模型的建立。C组:正常对照组,HLA-A2阳性的健康人10例,设为正常对照组,其中男6例,女4例,年龄23～62岁,平均年龄40.4±12.1岁,用于细胞刺激培养方法的建立。2.实验方法（1）外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）分离空腹静脉采集全血标本,采用Ficoll淋巴细胞分离液分离PBMC。（2） HLA分型技术采用流式细胞技术快速检测HLA-A2抗原分型。（3）细胞刺激培养方法的建立分离后的PBMC悬液加HBcAg、HBV core18-27抗原肽段在5%CO₂、37℃湿润条件下培养2天,第三天以HBcAg、HBV core18-27抗原肽段、IL-2培养基换液,以后每两天按此培养基半量换液一次,第11天收集悬浮细胞,用4℃PBS缓冲液洗涤两遍,制成细胞悬液,流式细胞检测。（4）细胞相互作用模型的建立首先采用MACS磁分选技术分离CD4+CD25+Treg细胞,再将不含有CD4+CD25+Treg的PBMC贴壁2h,吸取悬浮细胞（此即为无Treg、无AC的PBMC）并获得AC。Treg分成两份,AC分成两份,将无Treg、无AC的PBMC平均分成四份,加到上述的四份细胞中,这样就获得有Treg、有AC的PBMC（模式一,记为M₁）,无Treg、有AC的PBMC（模式二,记为M₂）,有Treg、无AC的PBMC（模式三,记为M₃）,无Treg、无AC的PBMC（模式四,记为M₄）,上述四种模式的PBMC分别加HBcAg、HBV core18-27特异肽段、IL-2共同刺激,在5%CO₂、37℃湿润条件下培养11d后测定四聚体阳性（即CD8⁺Tetramer⁺）细胞频数。（5） Tetramer流式细胞技术测定PBMC中HBV特异CTL采用藻红蛋白（PE）标记的MHC-肽四聚体（Tetramer）和荧光色素（FITC）标记的anti-CD8⁺,通过双色标记流式细胞技术检测针对HBV Core18-27表位的特异性CD8⁺T细胞,并以针对HCV C区178-187表位的Tetramer作为对照。计数50 000个CD8⁺细胞,同时计数CD8⁺和Tetramer⁺双阳性细胞为HBV特异性CD8⁺细胞,并以占总计数CD8⁺细胞的百分比表示。（6） HBV病毒学指标的检测HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe及抗HBc采用微粒子酶联免疫法（MEIA）检测;HBV-DNA定量采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测,截止值为10³拷贝/ml。（7）血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定使用HITACHI 7600-110型全自动生化分析仪测定。（8）数据的统计学处理采用SPSS13.0统计软件中的相关方法。【结果】1.慢性乙肝患者组、慢性无症状HBV携带者组与正常对照组刺激前CD8⁺Tetramer⁺细胞频数均小于0.1%,刺激培养11d后,慢性乙肝患者组CD8⁺Tetramer⁺平均频数为0.99±0.44%,慢性无症状HBV携带者组CD8⁺Tetramer⁺平均频数为0.88±0.42%,均较刺激前增加,有统计学差异（P＜0.01）。刺激培养后慢性乙肝患者组与慢性无症状HBV携带者组CD8⁺Tetramer⁺频数比较没有统计学差异（P=0.67）。健康对照组刺激后CD8⁺Tetramer⁺频数仍小于0.1%,与刺激前没有统计学差异。2.慢性乙肝患者组（A组）与慢性无症状HBV携带者组（B组）Treg、AC、CTL细胞相互作用结果（1）有Treg、有AC时（M₁）,CD8⁺Tetramer⁺平均频数A组为0.40±0.17%,B组为0.36±0.21%;两者相比无统计学差异（P＞0.05）。（2）无Treg、有AC时（M₂）,CD8⁺Tetramer⁺平均频数A组为0.69±0.28%,B组为0.73±0.37%;两者相比无统计学差异（P＞0.05）。（3）有Treg、无AC时（M₃）,CD8⁺Tetramer⁺平均频数A组为1.31±0.51%,B组为1.38±0.47%;两者相比无统计学差异（P＞0.05）。（4）无Treg、无AC时（M₄）,CD8⁺Tetramer⁺平均频数A组为1.75±0.64%,B组为1.72±0.55%;两者相比无统计学差异（P＞0.05）。3.慢性乙型肝炎患者组,不同模式间CD8⁺Tetramer⁺平均频数比较（1） M₁、M₂、M₃均低于M₄,有统计学意义（P＜0.01）;（2） M₁、M₂均低于M₃,有统计学意义（P＜0.01）;（3） M₁低于M₂,有统计学意义（P＜0.01）;（4） M₂低于M₃,有统计学意义（P＜0.01）。【结论】（1）采用IL-2、HBcAg、HBV core18-27抗原肽共同刺激培养,可以提高HBVcore18-27特异CTL细胞的数量。（2）刺激培养后慢性乙型肝炎患者组与慢性无症状HBV携带者组外周血抗原特异性CTL水平增殖无明显差异。（3）不管AC存在与否,Treg均可抑制CTL细胞的增殖（4）不管Treg存在与否,AC均可抑制CTL细胞的增殖。（5） Treg与AC同时存在时,其抑制CTL细胞增殖的能力大于它们单独作用。（6）在慢性乙肝中,AC抑制CTL细胞增殖的能力大于Treg。