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第一部分烟草烟雾暴露对小鼠中性粒细胞诱捕网形成的影响及红霉素干预作用的研究目的探讨烟草烟雾暴露对小鼠中性粒细胞诱捕网(NETs)形成的影响及红霉素干预的作用。方法将鼠龄6-8周的雄性Balb/c小鼠按随机数字表法分为空气暴露组、慢性烟草烟雾暴露组,慢性烟草烟雾暴露组用烟草烟雾暴露24周,空气暴露组空气伪暴露24周;分离纯化小鼠外周血中性粒细胞,免疫荧光法观察两组小鼠中性粒细胞形成NETs的情况;分离小鼠血清,观察两组小鼠血清对NETs降解的能力;制备CSE,体外观察烟草烟雾提取物(CSE)刺激中性粒细胞发生NETosis的情况,同时应用免疫荧光共聚焦法观察不同刺激因素诱导产生NETs的形态特征及组成结构;探讨红霉素干预对CSE刺激中性粒细胞形成NETs的影响。结果(1)与空气暴露组小鼠比较,慢性烟草烟雾暴露组小鼠中性粒细胞形成NETs的倾向更为明显。(2)与空气暴露组小鼠比较,慢性烟草烟雾暴露组小鼠血清对NETs的降解能力明显减弱。(3)体外研究发现,CSE刺激能直接诱导中性粒细胞发生NETosis;与空气暴露组小鼠比较,慢性烟草烟雾暴露组小鼠中性粒细胞对CSE的刺激更为敏感。(4)免疫荧光共聚焦结果表明,CSE诱导的NETs在形态特征及在保守蛋白组蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶及髓过氧化物酶的组成上,与PMA诱导的NETs无明显差别。(5)红霉素干预能显著抑制CSE诱导中性粒细胞NETs的形成。结论慢性烟草烟雾暴露环境中,NETs形成与降解的失衡可能促进小鼠肺部慢性炎症的发生发展。红霉素干预可能通过抑制烟草烟雾刺激诱导的NETs形成从而减轻肺部炎症。第二部分烟草烟雾提取物诱导的中性粒细胞诱捕网对浆样树突状细胞活化的作用及机制研究目的探讨烟草烟雾提取物(CSE)诱导的中性粒细胞诱捕网(NETs)对浆样树突状细胞(p DCs)活化的作用及相关机制。方法将鼠龄6-8周的雄性Balb/c小鼠按随机数字表法分为空气暴露组、慢性烟草烟雾暴露组,慢性烟草烟雾暴露组用烟草烟雾暴露24周,空气暴露组空气伪暴露24周;HE染色观察小鼠肺组织病理变化,计算肺泡平均内衬间隔(Lm)评估小鼠肺气肿程度;分离小鼠外周血、脾脏及肺脏单个核细胞,流式细胞术检测两组小鼠Th1、Th17细胞表达情况;免疫磁珠法分选纯化空气暴露组及烟草烟雾暴露组小鼠脾脏p DCs,流式细胞术检测两组小鼠p DCs的表型特征及成熟情况;分离纯化小鼠外周血中性粒细胞,制备CSE,体外CSE刺激诱导中性粒细胞形成NETs,提取CSE诱导的NETs;体外以CSE诱导的NETs刺激空气暴露组小鼠脾脏p DCs,流式细胞术检测p DCs共刺激分子的表达情况,ELISA检测培养液上清IFN-α、IL-6及IL-12p70的浓度;免疫磁珠法分离纯化小鼠脾脏初始CD4+T淋巴细胞,建立p DCs-初始CD4+T淋巴细胞共培养体系,流式细胞术检测初始CD4+T淋巴细胞的分化情况及转录因子T-bet、ROR-γt的表达水平。结果(1)与空气暴露组小鼠比较,慢性烟草烟雾暴露组小鼠肺泡间隔断裂,肺泡腔扩大并融合呈肺大疱,Lm值显著增大。(2)与空气暴露组小鼠比较,慢性烟草烟雾暴露组小鼠外周血、脾脏及肺部CD4+T淋巴细胞表现为Th1、Th17分化优势。(3)与空气暴露组小鼠比较,慢性烟草烟雾暴露组小鼠脾脏p DCs高表达MHC-Ⅱ分子及共刺激分子CD40、CD86,表现出成熟及活化的表型特征。(4)体外予CSE诱导的NETs刺激空气暴露组小鼠脾脏p DCs,结果显示CSE诱导的NETs能显著上调p DCs表达MHC-Ⅱ分子及共刺激分子CD40、CD86,促进p DCs的成熟与活化。(5)予CSE诱导的NETs刺激空气暴露组小鼠脾脏p DCs,结果显示CSE诱导的NETs能有效刺激p DCs分泌细胞因子IFN-α、IL-6及IL-12p70。(6)p DCs-初始CD4+T淋巴细胞共培养实验证实,与单纯p DCs相比,NETs刺激活化的p DCs能显著诱导初始CD4+T淋巴细胞向Th1、Th17细胞分化,刺激IFN-γ及IL-17的分泌。(7)p DCs-初始CD4+T淋巴细胞共培养实验证实,与单纯p DCs相比,NETs刺激活化的p DCs能显著上调初始CD4+T淋巴细胞转录因子T-bet和ROR-γt的表达。结论慢性烟草烟雾暴露状态下,烟草烟雾诱导的NETs可促进p DCs成熟与活化,继而启动Th1、Th17细胞介导的异常免疫反应,可能导致肺部慢性炎症的放大和持续。第三部分稳定期慢性阻塞性肺疾病患者外周浆样树突状细胞的表达及意义探讨目的探讨稳定期慢性阻塞性肺疾病患者外周浆样树突状细胞的表达及意义方法收集35例2015年5月至2016年5月广西医科大学第一附属医院及南宁市第八人民医院门诊的稳定期慢性阻塞性肺疾病患者。同时收集不吸烟健康人15例及吸烟肺功能正常者15例作为对照组。流式细胞术检测各组外周血Th1及Th17细胞的表达水平;流式细胞术检测各组外周血p DCs的表型特征;ELISA检测各组血清中p DCs相关细胞因子IL-6、IL-12及IL-23的浓度;采用相关性分析慢性阻塞性肺疾病患者血清中p DCs相关细胞因子IL-6、IL-12及IL-23浓度与外周血Th1及Th17细胞表达水平的相关性。结果(1)外周血CD4+T淋巴细胞在不吸烟健康人、吸烟肺功能正常者及COPD患者三组间差别没有明显统计学意义。但与不吸烟健康人、吸烟肺功能正常者相比,COPD患者的外周血Th1与Th17细胞比例明显升高,差异具有统计学意义。(2)与不吸烟健康人、吸烟肺功能正常者相比,COPD患者血清中IFN-γ与IL-17A浓度明显升高,差异具有统计学意义。(3)外周血p DCs占PBMC中的比例在不吸烟健康人、吸烟肺功能正常者及COPD患者三组间无明显差别。与不吸烟健康人相比,吸烟肺功能正常者的外周p DCs表达CD40及CD86明显上调,以COPD患者CD40及CD86的表达上调更为显著。(4)与不吸烟健康人、吸烟肺功能正常者相比,COPD患者血清中IL-6、IL-12及IL-23的表达水平显著增高。(5)相关性分析发现,COPD患者血清中IL-12表达水平与外周血Th1比例呈明显正相关,血清IL-6与IL-23表达水平与外周血Th17比例呈明显正相关。结论外周过度活化的p DCs可能是导致COPD异常的Th1、Th17细胞应答的机制之一。