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离子通道在动植物体内都有着广泛的分布,它们是一类特殊的大分子跨膜蛋白,能够在蛋白结构的中间部位形成水分子孔隙,这些孔隙形成了水溶性物质和带电离子等快速进出细胞的通道。离子通道具有十分重要的生理作用,它们参与血管、膀胱和平滑肌等的收缩调节,神经兴奋性的传递,腺体的分泌,动作电位的发放等各种生理活动。离子通道一旦突变或者不工作都将引起众多临床疾病的发生。深入研究离子通道的结构和功能特性以及通道与多肽药物间的毒性分子机制,对进一步揭示通道与疾病机理的相关性从而找到有效的治疗方法具有重大实用意义。文中我们结合电生理膜片钳和免疫荧光等多种相关技术主要从α亚基与β2辅助亚基间的相互作用机制以及多肽药物对离子通道的阻断毒性机制两个方面对离子通道的结构功能特性以及通道与多肽药物间的联系进行了研究和讨论。 论文中主要包含两部分的内容: 第一部分:内容主要使用了膜片钳电生理和荧光共聚焦成像技术,对辅助亚基β2如何调节果蝇属BK通道的功能特性进行了研究。主要成果包括: (1)果蝇属BK通道α亚基(dSlo1)与辅助亚基β2结合后,通道电流没有完全失活现象。 (2)dSlo1/β3-β2通道的激活速率减慢,呈现慢激活特性。 (3)dSlo/β2通道较mSlo/β2通道有更强的预失活特性。 之前的研究证实了BK通道的“C-linker and AC region”结构区域对调节Ca2+离子门控特性,二价离子结合(Ca2+和 Mg2+)和药物结合(H+,CO和酒精等)非常重要,而我们的研究证实了“C-linker and AC region”结构区域在BK通道功能亚基α与辅助亚基β2间的相互调节中的重要作用,为将来进一步阐释β2亚基如何调控dSlo1通道奠定了坚实基础,也为我们理解其它BK(βX)通道复合体的激活和失活机制的研究提供了新的思路。 第二部分:的内容主要是通过膜片钳的方法,检测体外合成多肽毒素MVIIA的生理活性并研究分析该毒素的毒性分子机制。主要成果包括: (1)首先,我们检测出体外合成多肽毒素MVIIA对N-型钙离子通道电流存在明显的抑制作用,且与Sigma公司购买的MVIIA具有近乎一致的抑制效果。 (2)其次,为了研究MVIIA的毒性分子机制,我们对P/Q-型钙离子通道电流也进行了毒性测试,发现其并不具有抑制作用,说明该类多肽具有通道选择特异性。可能并不是引起MVIIA毒素副作用的来源。 (3)最后,我们结合多肽SO-3(与MVIIA具有相似的结构和镇痛活性),发现MVIIA的毒性主要来源于loop2区第12位氨基酸残基Met12,该残基可以插入N-型钙通道(Cav2.2)结构 II和 III区域的疏水孔区(Ile300,Phe302,Leu305),降低MVIIA对Cav2.2通道电流的恢复率,进而达到增强毒性的效果。 MVIIA是一种特殊的N-型钙离子通道抑制剂,虽然已经用于慢性痛疾病治疗,但其有多种副作用,例如头晕,眼花,困倦嗜睡,运动失调等。我们的研究中涉及的关于MVIIA多肽 loop2区域突变体嵌合体以及其它相关的多肽可用于以后对Cav2.2通道高效抑制,但具有低副作用的药物研究,对慢性痛疾病的治疗提供了一个有潜力的药物。