前言：　　经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary interventions，PCI)术的临床应用为冠心病的治疗开辟了新的领域，但PCI术后血管重建部位再狭窄(restenosis，RS)的发生严重影响了其远期疗效。动脉损伤后狭窄的形成是一个复杂的病理生理过程，血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的迁移、过度增殖和细胞外基质大量合成是导致血管内膜增厚管腔狭窄的主要原因。因此寻找有效的手段抑制新生内膜形成是预防再狭窄的主要措施之一。随着分子生物学的发展，基因治疗再狭窄可能是一种很有前景的治疗方法。脱氧核酶(deoxyribozyme，DRz)是一种具有酶催化活性的DNA分子，作为一种基因抑制剂有着实际的治疗作用。小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)通过同其靶信使RNA作用在转录后水平抑制基因表达。　　研究表明，某些转录因子(transcription factors，TF)可以调节多个VSMC增殖相关基因的表达，从不同层面调控VSMC的迁移与增殖。同时，人们也逐渐注意到细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在血管重塑过程中的重要地位，ECM是新生内膜的主要成分及参与再塑形的主要元素，调节平滑肌细胞的增殖和迁移，是形成再狭窄的主要物质。TF与ECM在介导VSMC增殖、迁移的过程中密不可分，将二者有机地联系在一起，并对其相互作用关系进行深入探讨，将有助于全面了解血管重塑的细胞与分子机制。　　早期生长反应因子-1(early growth response factor-1，Egr-1)是一种即刻早期基因产物和锌指结构TF，也是一种DNA结合蛋白，可以与富含GC的序列结合而调节转录。研究发现，Egr-1调控着多种与细胞增殖相关基因的表达，从而诱导VSMC的分裂、增殖和内膜增生，因此与细胞增殖关系密切。　　骨桥蛋白(osteopontin，OPN)作为ECM中一种重要的功能性蛋白，研究表明，OPN在大鼠血管损伤后新生内膜中的表达明显上调，而且能促进VSMC、外膜细胞的迁移，被认为是血管损伤修复过程中的始动因素。研究发现，许多参与PCI术后RS的细胞因子均能够刺激VSMC过度表达OPN，提示OPN参与RS的形成，同时发现，应用抗OPN抗体可以抑制VSMC的表型转化、增殖和迁移，进而抑制RS的形成。　　Egr-1和OPN在介导VSMC迁移、增殖过程中均起着重要的作用，密不可分。本课题组在细胞水平首次证实了Egr-1与OPN之间存在着正相关性，Egr-1能够与OPN启动子结合调控其转录表达，同时，OPN也可以通过ERK途径正反馈上调Egr-1表达，二者形成一个作用级联放大的正反馈环。为了在动物水平验证Egr-1与OPN的相关性及相互作用机制，本实验拟在以往研究的基础上，在大鼠颈总动脉球囊损伤模型上，分别转染ED5及OPN siRNA，观察转染前后OPN与Egr-1的表达变化分析二者的相关性并通过染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)方法检测Egr-1与OPN启动子的结合情况，同时通过加入细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)磷酸化抑制剂PD98059，检测抑制ERK磷酸化后，OPN上调Egr-1的水平变化，从而对二者相互调控的内在机制进行验证。同时观察将OPN siRNA转染球囊损伤的大鼠颈总动脉后，检测下游增殖基因（增殖细胞核抗原，proliferating cell nuclear antigen，PCNA及转化生长因子β1，transforming growth factorβ1，TGF-β1）、迁移基因(matrix metalloproteinases:基质金属蛋白酶2，MMP-2及基质金属蛋白酶14，MMP-14)的表达变化，从而进一步验证OPN siRNA抑制RS的作用。　　材料与方法：　　1、主要试剂　　Egr-1特异脱氧核酶(DNAenzyme/10-23 DRz，ED5)，由Invitrogen USA合成。在其3和5端进行硫代修饰，5端用FITC标记，以便于在荧光显微镜下观察转染后基因的分布情况。　　由广州锐博生物科技有限公司设计与合成3对OPN siRNA，同时合成1对与OPN基因序列无关的siRNA(SCR-siRNA)作为阴性对照和检验RNAi有效性的指标，所有siRNA序列进行甲基化修饰增加稳定性，部分SCR-siRNA的5端用Cy3标记，以便于观察转染后基因的分布情况。　　2、VSMC原代培养及鉴定　　采用组织块贴壁法行大鼠平滑肌细胞原代培养，倒置显微镜下观察其形态，小鼠抗大鼠α-SM-actin单克隆抗体免疫荧光鉴定。　　3、OPN siRNA的筛选　　实验设置阴性siRNA组（转染SCR组）及阳性siRNA组(转染001 siRNA，转染002siRNA，转染003siRNA)。使用Fugene6转染OPN siRNA进入平滑肌细胞，应用实时RT-PCR检测siRNA转染后VSMC的OPN mRNA的表达。　　4、大鼠颈总动脉损伤模型的制作　　健康雄性Wistar大白鼠，体重350-400 g，10％水合氯醛(300mg/kg)麻醉后，颈正中切开，钝性分离左颈总动脉，血管夹暂时阻断左颈总动脉近心、远心端血流，用1.5mm球囊导管从颈外动脉插入左颈总动脉内，施以3-4atm压力，然后回拉球囊至分叉处重复3次，造成左颈总动脉内膜损伤。　　5、实验分组及处理　　(1)126只雄性Wistar大白鼠，随机分为7组，每组18只，每组再按术后3、7、14天分为3个亚组，每亚组6只。　　在体ED5转染:球囊拉伤后，将200μl转染复合物（含有FITC-ED5500μg、转染试剂Fugene630μl及1 mmol/L MgCl2溶液）注入至损伤的血管节段内，局部孵育20min。　　在体OPN-RNAi转染:球囊拉伤后，将200μl转染复合物（含有Cy3-OPNSCR-siRNA15μg的30％pluronic gel溶液）注射至损伤的血管周围，结扎颈外动脉，缝合颈部创口。　　MgCl2对照组:球囊拉伤颈总动脉后，局部注入200μl的1 mmol/L MgCl2液;Fugene6对照组:球囊拉伤颈总动脉后，局部注入200μl含Fugene630μl的1 mmol/LMgCl2液;ED5转染组:球囊拉伤颈总动脉后，局部释放200μl转染复合物（含Fugene630μl+ ED5500μg的1mmol/L MgCl2溶液），以上三组均局部作用20分钟;　　Pluronic gel对照组:球囊拉伤颈总动脉后，损伤血管周围释放200μl的30％pluronic gel溶液;OPN SCR-siRNA转染组:球囊拉伤颈总动脉后，损伤血管周围释放200μl含OPN SCR-siRNA15μg的30％pluronic gel溶液;OPN siRNA转染组:球囊拉伤颈总动脉后，损伤血管周围释放200μl含OPN-siRNA15μg的30％Pluronic gel溶液;　　假手术组:只进行颈外动脉结扎，但不插入导管。　　术后第3、7、14天分批处死动物，取病变处血管生理盐水冲洗后，分别置于4％多聚甲醛和液氮中，用于HE染色、免疫组化、real-time RT-PCR及Western blot检测。　　(2)20只雄性Wistar大白鼠，以单纯球囊扩张侧血管为实验组，对侧血管为对照组。　　术后14d处死动物，分别取实验组病变处及对照组对应部位血管，生理盐水冲洗后，置于液氮中，用于ChIP方法检测。　　(3)90只雄性Wistar大白鼠，随机分为5组（假手术组、DMSO对照组、OPNsiRNA转染组、PD98059处理组及OPN siRNA转染+PD98059处理组），每组18只，每组再按术后3、7、14天分为3个亚组，每亚组6只。　　假手术组:只进行颈外动脉结扎，但不插入导管;DMSO对照组:球囊拉伤颈总动脉后，血管损伤局部立即给予200ul DMSO液孵育20分钟;OPN siRNA转染组:球囊拉伤颈总动脉后，损伤血管周围释放200μl含OPN siRNA15μg的30％pluronic gel溶液;PD98059处理组:球囊拉伤颈总动脉后，血管损伤局部立即给予200ul含100ug PD98059的DMSO液孵育20分钟;OPN siRNA转染+PD98059处理组:球囊拉伤颈总动脉后，血管损伤局部立即给予200ul DMSO液孵育20分钟，损伤血管周围释放200μl含OPN siRNA15μg的30％pluronic gel溶液。　　术后第3、7、14天分批处死动物，取病变处血管生理盐水冲洗后，置于液氮中用于Western blot检测。　　6、免疫组织化学法检测OPN、PCNA、TGF-β1、MMP-2、MMP-14的蛋白表达　　7、real-time RT-PCR法测定VSMC的OPN mRNA及血管壁组织的Egr-1、OPN、PCNA、TGF-β1、 MMP-2、MMP-14 mRNA表达　　8、Western blot检测Egr-1、OPN、PCNA、TGF-β1、MMP-2、MMP-14、ERK、P-ERK蛋白含量表达　　9、ChIP方法检测Egr-1与OPN启动子的结合　　10、统计学处理　　所有数据采用SPSS16.0软件包进行统计分析，计量资料以均数±标准差((x)±SD)表示，不同组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，Egr-1及OPN相关性用双变量相关分析法(Spearman相关分析)，p＜0.05为差异有显著性。　　结果：　　1、体外培养的大鼠VSMC的鉴定　　组织块贴壁法培养5-7天后可见原代细胞从组织块边缘爬出，3-4周后可长成单层融合细胞，呈VSMC的典型“峰-谷”状生长。VSMC特异性标志蛋白α-SM-actin免疫细胞化学染色阳性。　　2、VSMC real-time RT-PCR的结果　　OPN002 siRNA转染后的VSMC的OPN mRNA显著降低，沉默效应最好，与OPN SCR-siRNA对照组相比，沉默了76.86％，OPN002 siRNA组抑制效果最明显，被选出做进一步实验。　　3、在体基因转染效果观察　　分别于转染治疗基因FITC-ED524小时及Cy3-OPN SCR-siRNA72小时后，取治疗局部血管的冰冻切片置于荧光显微镜下，分别用480hm、550 nm光激发可见残存血管内膜及中膜有大量绿色、红色荧光分布，证明转染成功。　　4、血管病理形态学检测结果　　光镜下可见:在假手术组，大鼠颈总动脉内膜完整;在Fugene6组、MgCl2对照组、Pluronic gel对照组及OPN SCR-siRNA转染组，7d时可见内膜增生，14d时内膜明显增生，ED5组与同一时间点Fugene6组及MgCl2对照组相比，OPN002siRNA组与同一时间点30％Pluronic gel对照组及OPN SCR-siRNA转染组相比，内膜增生受到抑制(p＜0.001)。　　5、OPN002 siRNA调节下游基因表达　　(1)OPN、PCNA、TGF-β1、MMP-2、MMP-14免疫组化结果　　在假手术组， PCNA不表达，OPN、TGF-β1、MMP-2、MMP-14仅微弱表达;血管球囊损伤后3、7和14天，血管壁内膜和中膜的细胞胞浆及胞核中有棕黄色颗粒，并逐渐增多，经OPN002 siRNA治疗后，同一时间点阳性细胞表达明显减少，与OPN SCR-siRNA转染组及Pluronic gel对照组比较差异有显著性(p＜0.001)。　　(2)real-time RT-PCR检测结果　　在假手术组，PCNA mRNA不表达，OPN、TGF-β1、MMP-2、MMP-14 mRNA仅微弱表达;血管球囊损伤后，OPN、PCNA、TGF-β1、MMP-2、MMP-14 mRNA表达明显升高:OPN、TGF-β1 mRNA随时间的延长持续升高;MMP-14 mRNA表达3天达峰;PCNA、MMP-2 mRNA表达7天达峰。经OPN002 siRNA治疗后，同一时间点OPN、PCNA、TGF-β1、MMP-2、MMP-14 mRNA表达明显减少，与SCR-siRNA转染及Pluronic gel对照组比较差异有显著性(p＜0.001)。　　(3)Western blot检测结果　　在假手术组，无PCNA蛋白条带，OPN、TGF-β1、MMP-2、MMP-14有微弱蛋白条带表达;然而，血管球囊损伤3、7、14d后，OPN、PCNA、TGF-β1、MMP-2、MMP-14蛋白条带灰度均逐渐增加，MMP-14表达3天最明显，PCNA、MMP-2表达7天最明显，OPN、TGF-β114天最明显。经OPN002 siRNA治疗后，同一时间点OPN、PCNA、TGF-β1、MMP-2、MMP-14表达明显减少，与OPN SCR-siRNA转染及Pluronic gel对照组比较差异有显著性(p＜0.001)。　　6、在大鼠颈总动脉球囊损伤模型，双变量相关性分析结果　　Egr-1与OPN的表达在转录水平上呈正相关性(r=0.886，p＜0.001，n=18);同时，Egr-1与OPN的表达在翻译水平上呈正相关性(r=0.765，p＜0.001，n=18)。　　7、ChIP方法检测Egr-1与OPN启动子的结合　　在正常对照组的OPN基因启动子区域存在一定的Egr-1水平，相对富集率为0.1972;单纯球囊扩张14天后，OPN基因启动子区域的Egr-1水平大增，相对富集率为0.7981，表明OPN基因转录启动子区域存在(—)Egr-1的结合位点。　　8、Western blot法检测OPN、Egr-1、ERK及P-ERK蛋白含量变化，分析它们之间的相互作用关系　　DMSO组与同一时间点假手术组比较，OPN、P-ERK/ERK及Egr-1有所升高;OPN002 siRNA转染组与同一时间点DMSO组比较，OPN、P-ERK/ERK及Egr-1均减少;PD98059处理组与同一时间点DMSO组比较，P-ERK/ERK及Egr-1均减少;OPN002 siRNA转染+PD98059处理组与OPN002 siRNA转染组及PD98059处理组比较，P-ERK/ERK及Egr-1均明显减少(p＜0.001)，表明PD98059可以有效抑制ERK的磷酸化，阻断OPN对Egr-1的上调。　　结论：　　1、OPN002 siRNA明显抑制平滑肌细胞中OPN的mRNA表达，具有RNAi作用。　　2、在大鼠颈总动脉球囊损伤模型中，OPN002 siRNA可成功转染。　　3、在大鼠颈总动脉球囊损伤模型中，OPN002 siRNA可有效地抑制下游增殖基因(PCNA、TGF-β1)及迁移基因(MMP-2、MMP-14)的表达。　　4、在大鼠颈总动脉球囊损伤模型中，Egr-1无论在转录水平还是在翻译水平均可影响OPN的表达;同样，OPN也可以影响Egr-1的表达，二者的表达呈正相关性。　　5、在大鼠颈总动脉球囊损伤模型中，OPN启动子区域存在着Egr-1的结合位点，OPN可以通过ERK途径反馈上调Egr-1的表达，Egr-1与OPN之间形成一个作用级联放大的正反馈环。