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第一部分结扎小鼠不同脊神经制备的脊神经结扎模型的比对研究目的：比较结扎小鼠L4或L5脊神经制备的脊神经结扎模型(SNL)的造模效果。方法：解剖C57BL/6J小鼠坐骨神经,比较L4、L5脊神经不同。C57BL/6J小鼠随机分为假手术组(Sham)、L4脊神经结扎组(L4)及L5脊神经结扎组(L5),术后比较各组小鼠后足改变。各组小鼠于手术前(基线)、术后第1、3、5、7、14天分别测定机械痛敏压力阈值(PWMT)及热刺激缩足反射潜伏期(PWTL)。术后第3、7天各取3只,取脊髓腰膨大,蛋白电泳检测术侧脊髓p-CREB的表达。结果：C57BL/6J小鼠坐骨神经由部分L3神经、L4神经、L5神经组成,L4神经最粗,L5神经细长。Sham组及L5组小鼠术后步态、姿势无明显改变。L4组小鼠术侧后爪内收畸形,休息时术侧后爪经常处于保护姿势。L4组小鼠的PWMT及PWTL较L5组低。L4组术后3天及7天脊髓p-CREB表达较L5组明显上调。结论：结扎L4脊神经制作的SNL模型更简单、痛敏更明显,更符合理想疼痛模型。第二部分IL-17A在小鼠神经病理性疼痛中的作用目的：研究IL-17A在L4脊神经结扎(SNL)模型脊髓的表达情况及脊髓IL-17A在神经病理性疼痛的中的作用。方法：C57BL/6J小鼠SNL后第1、3、5、7、14天各取3只,取脊髓腰膨大,蛋白电泳检测术侧脊髓IL-17A及GFAP的表达趋势,第7天灌注处死3只,冰冻切片免疫荧光双标检测脊髓腰膨大IL-17A/GFAP共表达情况。野生型C57BL/6J小鼠随机分为假手术组(Sham)、脊神经结扎组(WT SNL), IL-17A基因敲除小鼠组结扎L4神经(IL-17A-/-SNL)。各组小鼠于手术前(基线)、术后第1、3、5、7、14天分别测定机械痛阈值和热痛阈值,术后第7天各组取3只,取脊髓腰膨大,蛋白电泳检测术侧脊髓IL-17A、GFAP。鞘内置管+SNL后第7天的C57BL/6J小鼠随机分为注射溶剂组(Vehicle)、IL-17A中和抗体组(Anti-IL-17A),鞘内注射后1小时及2小时检测PWMT及PWTL。鞘内置管后小鼠随机分为Vehicle组、重组IL-17A组(rIL-17A,50ng)组、rIL-17A (100ng)组。鞘内注射后1小时及2小时检测PWMT及PWTL.鞘内置管后小鼠随机分为Vehicle组、rIL-17A (100ng)组、rIL-17A+Anti-IL-17A组。鞘内注射后1小时及2小时检测PWMT及PWTL。结果：同Sham比较,SNL后1、3、5、7、14天IL-17A及GFAP表达增高。脊髓IL-17A和GFAP免疫荧光共表达。同野生型比较,IL-17A-/-SNL组小鼠脊髓GFAP表达减少。SNL后,IL-17A基因敲除、中和内源性IL-17A可以明显提高机械痛阈及热痛阈。正常小鼠鞘内注射100ng rIL-17A明显诱发小鼠机械痛及热痛,中和抗体抵消所诱发的热痛。结论：脊神经结扎后,IL-17A由活化的脊髓星型胶质细胞分泌并促进神经病理性疼痛的发生及维持。第三部分CREB磷酸化在IL-17A痛觉信号通路的作用目的：在本研究旨在确定IL-17A是否通过磷酸化CREB促进神经病理性疼痛的痛觉过敏。方法：C57BL/6J小鼠SNL后第1、3、5、7、14天各取3只,取脊髓腰膨大,蛋白电泳检测术侧脊髓p-CREB,第7天灌注处死3只,冰冻切片免疫荧光双标检测脊髓腰膨大p-CREB/NeuN共表达情况。野生型C57BL/6J小鼠随机分为Sham及WT SNL两组,加17A-/-SNL组,术后第7天各组取3只,取脊髓腰膨大,蛋白电泳检测术侧脊髓p-CREB。鞘内置管+SNL后第7天的C57BL/6J小鼠随机分为Vehicle组、Anti-IL-17A组。注药后2小时取脊髓腰膨大,蛋白电泳检测术侧脊髓p-CREB。鞘内置管后小鼠随机分为Vehicle组、rIL-17A (50ng)组、rIL-17A (100ng)组。鞘内注射后2小时取脊髓腰膨大,蛋白电泳检测术侧脊髓p-CREB。鞘内置管后小鼠随机分为Vehicle组、rIL-17A (100ng)组、rIL-17A+Anti-IL-17A组。鞘内注射后2小时取脊髓腰膨大,蛋白电泳检测术侧脊髓p-CREB。原代培养的脊髓神经元第7天,随机分为Vehicle组、rIL-17A (lOng)组、rIL-17A (100ng)组。rIL-17A刺激后15分钟细胞免疫荧光检测p-CREB表达。原代培养的脊髓神经元随机分为Vehicle组,rIL-17A(100ng)组、rIL-17A+Anti-IL-17A组,rIL-17A刺激后15分钟细胞免疫荧光检测p-CREB表达。结果：同假手术组比较,SNL后1、3、5、7、14天p-CREB表达增高。免疫荧光提示脊髓p-CREB/NeuN共表达。IL-17A基因敲除、中和内源性IL-17A可以明显降低脊神经结扎所致p-CREB高表达,正常小鼠鞘内注射rIL-17A增加脊髓p-CREB表达,以注射100ng后2小时后表达明显,中和抗体可以减少rIL-17A所致p-CREB表达。100ng rIL-17A刺激原代培养的脊髓神经元p-CREB表达明显,中和抗体可以减少rIL-17A所致p-CREB表达。结论：IL-17A通过促进CREB的磷酸化参与了脊神经结扎致神经病理性疼痛的产生与维持第四部分CaMKII磷酸化在IL-17A/CREB信号通路中的作用目的：本研究旨在研究CaMKII磷酸化在IL-17A/CREB疼痛信号通路的作用。方法：野生型C57BL/6J小鼠随机分为Sham及WT SNL, C57BL/6J背景的IL-17A基因敲除小鼠结扎L4神经(17A-/-SNL),术后第7天取脊髓腰膨大,蛋白电泳检测术侧脊髓p-CaMKⅡ。鞘内置管+SNL后第7天的C57BL/6J小鼠随机分为Vehicle组、Anti-IL-17A组,鞘内注射后2小时取脊髓腰膨大,蛋白电泳检测术侧脊髓p-CaMKⅡ。鞘内置管后小鼠随机分为Vehicle组、rIL-17A (50ng)组、rIL-17A (100ng)组,鞘内注射后2小时取脊髓腰膨大,蛋白电泳检测术侧脊髓p-CaMKⅡ。鞘内置管后小鼠随机分为Vehicle组、rIL-17A (100ng)组、rIL-17A+Anti-IL-17A组,鞘内注射后2小时取脊髓腰膨大,蛋白电泳检测术侧脊髓p-CaMKⅡ。鞘内置管+SNL后第7天的C57BL/6J小鼠随机分为溶剂组、KN93组,鞘内注射后1小时及2小时测PWMT及PWTL,2小时后取脊髓腰膨大,蛋白电泳检测术侧脊髓p-CREB及p-CaMKⅡ。鞘内置管后小鼠随机分为溶剂组、rIL-17A (100ng)组、rIL-17A (100ng)+KN93组,鞘内注射后1小时及2小时测PWMT及PWTL,2小时后取脊髓腰膨大,蛋白电泳检测术侧脊髓p-CREB及p-CaMKII。原代培养的脊髓神经元随机分为溶剂组、rIL-17A(100ng)组、rIL-17A (100ng)+KN93组,预先30分钟给KN93, rIL-17A刺激后15分钟细胞免疫荧光检测p-CREB表达。结果：IL-17A基因敲除、中和内源性IL-17A可以明显降低脊神经结扎所致p-CaMKII高表达,正常小鼠鞘内注射rIL-17A增加脊髓p-CaMKⅡ表达,以注射100ng后2小时后表达明显,中和抗体可以减少rIL-17A所致p-CaMKⅡ表达。SNL鼠鞘内注射KN93后减轻痛敏,抑制p-CaMKⅡ、p-CREB表达。鞘内注射rIL-17A诱发的痛敏及p-CaMKⅡ和p-CREB的高表达,可以被KN93抑制。100ng rIL-17A刺激原代培养的脊髓神经元p-CREB表达明显,KN93可以减少其所致p-CREB高表达。结论：IL-17A通过促进CaMKⅡ的磷酸化,以诱发CREB的磷酸化,参与了脊神经结扎神经病理性疼痛的产生与维持。