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大肠癌（colorectal cancer,CRC）是消化道常见的恶性肿瘤之一,且全球发病率有逐年升高趋势,给众多家庭和社会造成了巨大的经济负担。手术是早期大肠癌的根治方法,而中晚期大肠癌患者则依赖于化疗、放疗以提高5年生存率。然而,由于原发性或继发性化疗耐药,尤其是肿瘤细胞中多药耐药（MDR）的出现是导致化疗失败的主要原因之一,使得化疗效果不佳,患者的预后差。因此,克服大肠癌多药耐药和提高化疗效果是目前亟待解决的问题。多药耐药意指肿瘤细胞对初次接触的药物即产生抗药性,并且对结构和机制均不同的未接触过的多种抗肿瘤药物也产生交叉耐药。产生MDR的机制复杂多样,但以转运蛋白的活化最为主要。本课题所研究的转运蛋白包括两种,即P-糖蛋白（P-gp）,多药耐药相关蛋白2（MRP2）,这两种转运蛋白同属于ABC家族,其中P-gp由ABCB1基因编码,MRP2由ABCC2基因编码。目前研究发现,PI3K/Akt信号通路的激活在大肠癌多药耐药过程中起到调节的作用,并且是细胞生存通路之一。GSK3β（糖原合成酶激酶3β）作为其下游的主要靶因子之一,PI3K/Akt通路激活后通过磷酸化GSK3β丝氨酸9位点来抑制其的活性,它还通过调节细胞增殖、凋亡及周期等参与肿瘤细胞的发生与发展,是肿瘤细胞的关键调节因子。据报道,GSK3β-Ser9磷酸化增加可上调P-gp的表达,促使胆管癌细胞多药耐药的发生。但在大肠癌中GSK3β与ABC转运蛋白之间的关系鲜有报道。目的:研究PI3K/Akt信号通路通过下游的GSK3β途径调控ABC转运蛋白的表达参与大肠癌多药耐药方法:1.实验分为三组:大肠癌HCT-15细胞作为对照组,HCT-15+GSK3β抑制剂（Indirubin-3’-monoxime,HY-19807）、HCT-15+PI3K/Akt通路抑制剂（GDC-0032,HY-13898）分别作为实验组。2.Western blotting法检测三组细胞内Akt、p-Akt、总GSK3β、p-GSK3β-Ser9及ABC转运蛋白（P-gp、MRP2）的表达变化。3.qRT-PCR法检测各组细胞内ABC转运蛋白mRNA的表达变化。4.采用CCK-8法检测奥沙利铂对三组细胞的半数抑制浓度,计算抑制率及耐药指数。5.细胞划痕实验及细胞周期实验检测不同抑制剂对细胞迁移能力及细胞周期的影响。6.应用SPSS19.0统计学软件进行统计分析,得出实验结论。结果:1 Western Blot实验结果1.1 GSK3β抑制剂（HY-19807）作用于人结肠癌HCT-15细胞后,GSK3β-Ser9磷酸化增加,P-gp、MRP2的表达较未用药的HCT-15组升高明显,差异有统计学意义（P<0.05）,GSK3β上游的Akt及p-Akt表达变化不明显,差异无统计学意义（P>0.05）。1.2 PI3K/Akt通路抑制剂（HY-13898）作用于人结肠癌HCT-15细胞后,p-GSK3β-Ser9、p-Akt表达下调,Akt表达增加,P-gp、MRP2蛋白的相对表达量均显著低于对照组,差异有统计学意义（P<0.01）。1.3应用不同抑制剂后与对照组相比总GSK3β在两个实验组中的表达变化不明显,无统计学意义（P>0.05）。2实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验结果2.1 HY-19807作用于HCT-15细胞后,GSK3β活性受抑制,qRT-PCR结果显示ABCB1 mRNA、ABCC2 mRNA表达较对照组升高明显,差异有统计学意义（P<0.01）。2.2 HY-13898作用于HCT-15细胞后,GSK3β被激活,qRT-PCR结果显示ABCB1 mRNA、ABCC2 mRNA相对表达量均明显低于对照组,差异有统计学意义（P<0.01）。3不同抑制剂作用于HCT-15细胞后对奥沙利铂敏感性的影响3.1应用HY-19807作用于人结肠癌HCT-15细胞后,奥沙利铂对HCT-15细胞的半数抑制浓度(IC50)由（19.83±0.8）μg/mL升至（27.15±1.57）μg/m L,耐药指数为1.36,差异有统计学意义（P<0.01）。3.2应用HY-13898作用于人结肠癌HCT-15细胞阻断PI3K/Akt信号通路激活后,奥沙利铂对HCT-15细胞的半数抑制浓度(IC50)由（19.83±0.8）μg/m L降至（9.93±1.77）μg/m L,耐药指数为0.5,差异有统计学意义（P<0.01）。4细胞划痕实验结果4.1细胞划痕24、48h后倒置显微镜下观察可见HCT-15细胞24h迁移率为（23.61±0.99）%,48h迁移率（34.76±10.75）%。4.2应用HY-19807作用于HCT-15细胞后,24h迁移率为（21.63±3.79）%,48h迁移率为（19.90±4.05）%,与对照组相比细胞迁移能力无明显促进,差异无统计学意义（P>0.05）。4.3应用HY-13898作用于HCT-15细胞后,24h迁移率为（12.63±0.52）%（P<0.01）,48h迁移率（17.76±7.83）%（P<0.05）。与对照组相比,细胞迁移能力受到抑制,尤以24h作用最为明显,差异具有统计学意义。5细胞周期实验结果5.1大肠癌HCT-15细胞不做任何处理,经流式细胞仪分析,G1期细胞占比（59.61±0.73）%,S期占比（23.38±0.74）%。5.2应用HY-19807处理HCT-15细胞2小时后,G1期细胞占（45.69±0.96）%,S期细胞占（39.77±0.92）%,与对照组相比较,G1期细胞百分率显著减少,S期细胞百分率显著增加,差异有统计学意义（P=0.000）。5.3应用HY-13898处理HCT-15细胞24小时后,G1期细胞占比（84.17±1.35）%,同时S期细胞占比（6.90±0.59）%,与对照组相比较,G1期细胞百分率明显增加,同时S期细胞百分率显著减少,差异有统计学意义（P=0.000）。结论:1 GSK3β抑制剂能够增加HCT-15细胞中p-GSK3β-Ser9及P-gp、MRP2蛋白的表达,PI3K/Akt通路抑制剂能够降低HCT-15细胞中p-GSK3β-Ser9及P-gp、MRP2蛋白的表达,从蛋白水平证实GSK3β-Ser9磷酸化状态能够调控大肠癌多药耐药相关蛋白的表达。2 GSK3β抑制剂能够增加HCT-15细胞中ABCB1 mRNA及ABCC2mRNA的表达,PI3K/Akt通路抑制剂能够降低HCT-15细胞中ABCB1mRNA及ABCC2 mRNA的表达,从基因水平证实通过改变GSK3β-Ser9磷酸化表达能够调控大肠癌多药耐药相关蛋白基因的表达。3 GSK3β抑制剂使HCT-15细胞对奥沙利铂的敏感性降低,PI3K/Akt通路抑制剂可增强HCT-15细胞对奥沙利铂的敏感性,GSK3β-Ser9的磷酸化水平影响大肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性。4在大肠癌细胞中,PI3K/Akt通路通过GSK3β途径调控ABC转运蛋白的表达。此外,GSK3β-Ser9的磷酸化水平能够影响大肠癌细胞的增殖能力。