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背景与目的源自神经上皮的肿瘤统称为脑胶质瘤(胶质细胞瘤),占颅脑肿瘤的40-50%,是最常见的颅内恶性肿瘤。以细胞异质性,快速增殖,血管生成,广泛性侵袭,缺氧和坏死为主要特点。一直以来,外科手术、放疗和化疗治疗作为脑胶质瘤的主要治疗方式虽然有一定的作用,但临床疗效和预后较差,因而寻找一种新的治疗靶点和治疗方式成为一种必然。小分子RNA(micro RNAs,mi RNAs)在脑胶质瘤中异常表达使其有望成为脑胶质瘤的新的诊断标志物,近年来大量相关研究层出不穷。mi RNA按照其在肿瘤的发生发展中的调控作用可分为致癌mi RNA和抑癌mi RNA,研究发现上调或下调mi RNA的表达水平对脑胶质瘤细胞的增殖、侵袭及凋亡有明显效应。FAK是一种酪氨酸激酶,在多种生物反应,包括细胞存活增殖和迁移起着关键的调节作用,增加FAK的表达与类肿瘤细胞侵袭力增强密切相关,研究发现FAK在脑胶质瘤中高表达。在本研究预实验所得结果也显示在脑胶质瘤组织中存在异常高表达的FAK,我们通过生物信息学软件分析得知mi R-138与FAK的3’UTR具有特异性结合位点,FAK可能为mi R-138的作用靶点。接下来我们进行一系列的实验目的在于进一步分析了解mi R-138和FAK在脑胶质瘤组织和正常组织中的表达水平,探究mi R-138表达异常升高对脑胶质瘤细胞增殖、侵袭以及凋亡的影响,初步验证mi R-138的作用靶点和调控机制。方法1.2014年8月到2015年7月近一年间,从郑州大学第一附属医院和郑州大学附属洛阳中心医院采集了20例由外科手术治疗获得郑州大学第一附属医院病理科鉴定为脑胶质瘤的临床样本和6例来自于郑州大学第一附属医院神经外科脑外伤手术患者的正常脑组织。2.应用Western blot实验检测组织标本中FAK蛋白的表达量;应用荧光定量PCR方法检测mi R-138和FAK m RNA的表达水平3.转染脑胶质瘤U-87 MG细胞。按不同的处理方式分为三组进行转染:a.mi R-138组:细胞中转染脂质体复合物和mi R-138 agomir;b.NC组,细胞中转染脂质体复合物和mi R-138 agomir negative control;c.Blank组,只加入脂质体。细胞转染后37℃,CO2浓度5%条件培养。经24h转染后,对转染效果进行验证,应用Western blot实验检测各组细胞中FAK蛋白的表达量;应用荧光定量PCR方法检测各组细胞中mi R-138和FAK m RNA的表达水平。4.CCK-8实验检测a、b、c三组细胞的增殖能力。5.Transwell实验检测a、b、c三组细胞的侵袭能力。6.流式细胞术检测a、b、c三组细胞的凋亡情况。7.裸鼠移植瘤模型建立后,应用小动物活体成像仪检测a、b、c三组中裸鼠瘤体的生长情况。8.生物信息学分析探索mi R-138与FAK是否存在互补的Seedregion区域。构建野生和突变型FAK3’UTR重组双荧光素报告基因载体,并与mi R-138激动剂(agomir)或mi R-138 agomir negative control共转染到U-87 MG细胞中,运用双荧光素报告实验进行验证。9.比较下调FAK与上调mi R-138对脑胶质瘤细胞的作用效果。将FAK-si RNAs和mi R-138 agomir分别转染到U-87 MG细胞中,比较两组细胞转染后对脑胶质瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的影响,并与空白对照组做比较。利用Westernblot检测FAK蛋白的表达量,荧光定量PCR方法检测各组细胞中mi R-138和FAK m RNA的表达水平。1.脑胶质瘤组织中mi R-138的表达水平较正常脑组织明显降低(P<0.05),FAK m RNA和FAK蛋白表达水平较正常脑组织明显升高(P<0.05)。2.U-87 MG细胞转染后,转染mi R-138 agomir和脂质体复合物组mi R-138的表达量明显高于空白对照组和NC组(P<0.05),而FAK m RNA的表达量明显低于空白对照组和NC组(P<0.05)。Western Blotting结果显示,转染mi R-138 agomir和脂质体复合物组FAK蛋白的表达量明显低于空白对照组和NC组(P<0.05),表明U-87 MG细胞转染mi R-138 agomir上调了mi R-138的表达水平,而FAK表达水平下降。3.CCK-8实验表明,与空白对照组和NC组吸光度值相比,转染mi R-138agomir和脂质体复合物组的细胞转染24h、48h、72h时在450nm波长下的吸光度值均明显下降(P<0.05),表明转染mi R-138之后,U-87 MG细胞的增殖能力显著降低。4.小动物活体成像仪检测裸鼠体内移植瘤增殖情况,结果显示,从第2周起,mi R-138组裸鼠移植瘤荧光信号较Blank组及NC组均明显降低(P<0.05),且随时间延长,mi R-138组细胞与Blank组及NC组荧光信号差异愈加显著(P<0.05)。表明上调mi R-138的表达可抑制裸鼠移植瘤生长。5.Transwell实验检测三组U-87 MG细胞的侵袭能力,结果显示:转染mi R-138agomir和脂质体复合物的细胞的穿膜细胞数明显低于Blank组和NC组(P<0.05)。6.流式细胞术检测结果显示转染mi R-138 agomir和脂质体复合物的细胞的凋亡百分比明显高于Blank组和NC组(P<0.05)。提示上调mi R-138表达水平对U-87 MG细胞的凋亡有促进作用。7.生物信息学检测显示基因FAK的3’UTR区可能是mi R-138的一个直接作用的下游靶点。实验成功构建野生型和突变型FAK 3’UTR重组双荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告实验结果显示:mi R-138与FAK的3’UTR野生型载体共转染组细胞荧光素酶活性显著低于其他3个对照组,说明FAK是mi R-138的靶基因。8.比较下调FAK与上调mi R-138对脑胶质瘤细胞的作用及FAK和mi R-138表达,检测结果显示,下调FAK与上调mi R-138在对细胞的增殖、侵袭和凋亡有类似的作用,表明mi R-138对于脑胶质瘤的抑制作用至少部分是通过调控FAK发挥作用的。结果结论1.脑胶质瘤组织中mi R-138表达呈现异常下调,而FAK表达则异常上调。2.上调mi R-138的表达可抑制脑胶质瘤细胞U-87 MG的增殖和侵袭能力,并能促进其凋亡。3.mi R-138可能通过作用于FAK的3’UTR区,负向调节FAK的表达在脑胶质瘤细胞中发挥生物学作用。