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猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染可造成各年龄段猪群发生腹泻、消瘦,感染仔猪死亡率可达80%~100%,急需有效药物用于特异性防控,但目前该病以免疫预防为主,没有合适且高效的药物。抗菌肽(Antimicrobial peptide,AMP)是动植物在天然免疫中产生的小分子多肽,有广谱抗微生物活性。已有文献报道抗菌肽对囊膜病毒的感染、增殖有较好的抑制作用,但未见其具体对猪流行性腹泻病毒的作用研究。本研究探索了本实验室合成的五种抗菌肽对PEDV的体外抑制效果,筛选出抗病毒活性较高的抗菌肽Caerin1.1,研究了其抗病毒活性和机制,主要结果如下:1.确定不同抗菌肽的抗病毒活性和细胞毒性分别用5种抗菌肽(Caerin1.1,Piscidin1,Maculatin1.1,Lactoferricin B,Indolicidin等)与PEDV孵育,测定TCID50。结果显示Caerin1.1与Piscidin1抑制效果显著,且Caerin1.1优于Piscidin1。在抗菌肽浓度低于110μg/m L的条件下,二者细胞毒性都很小,细胞相对活力均可达到80%以上,显微镜下观察细胞形态良好,因此后续研究中所用的抗菌肽浓度均处于安全范围内。2.Caerin1.1孵育条件及抑制效果探索分别设置孵育温度和孵育时间梯度,孵育后倍比稀释并接种Vero细胞,测定病毒TCID50,结果发现,最佳孵育条件为37℃孵育1h。Caerin1.1和Piscidin1对PEDV的抑制效果显著,但两者没有协同作用。Caerin1.1对3个不同PEDV毒株的抑制效果均十分显著且呈剂量依赖,PEDV-YN株病毒滴度可从10-4.5下降至10-1.5。3.抗菌肽Caerin1.1直接杀伤病毒,发挥其抗病毒作用设置抗菌肽与病毒作用的3个不同方式,即Caerin1.1与细胞提前孵育1h后接种PEDV;Caerin1.1与PEDV孵育1h后接种于细胞;细胞先接种PEDV 1h后加入Caerin1.1。测定TCID50,绘制生长曲线,结果表明Caerin1.1与病毒提前孵育时病毒滴度下降最多,其他两种处理方式时,PEDV滴度仅有一定程度下降,说明Caerin1.1发挥作用的主要阶段在与病毒直接孵育的过程。通过透射电子显微镜观察发现,抗菌肽和病毒孵育后破坏病毒囊膜完整性,Western blot试验发现,抗菌肽和病毒直接孵育后感染细胞,PEDV-N蛋白表达量显著下降,说明病毒感染细胞的能力下降,增殖被抑制。4.吸附入侵及释放阶段抑制效果探索通过增加4℃孵育时间,分别延长PEDV吸附和入侵细胞时间,随后加入Caerin1.1,孵育3h后弃去含抗菌肽的培养基,结果显示即使Caerin1.1浓度增加,病毒的滴度与病毒对照相比仍无显著差异,说明Caerin1.1对PEDV入侵和吸附宿主细胞的过程无抑制效果。病毒侵入细胞后(接毒1h后)加入抗菌肽,分别测定上清病毒和胞内病毒滴度,结果显示抗菌肽处理组的胞内病毒滴度与病毒对照组胞内病毒滴度无显著差异,说明病毒在细胞内的复制和组装并未受到抑制;而上清中PEDV的滴度有显著下降,且毒价上升趋势延缓,说明Caerin1.1可抑制病毒释放。对Caerin1.1进行FITC标记,细胞内定位结果显示Caerin1.1定位在细胞质;在无PEDV感染的对照组细胞中,Caerin1.1呈随机散在分布状态,而在PEDV感染的细胞中,Caerin1.1则呈聚集状态,与病毒的分布状况高度一致。综上所述,我们筛选出能有效抑制PEDV增殖的抗菌肽Caerin1.1和Piscidin1。发现Caerin1.1主要破坏病毒囊膜抑制病毒增殖,但也抑制病毒从细胞内释放。研究结果为防控PED提供了新的生物制剂。