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背景和目的急慢性肝衰竭是病毒性肝炎等各种病因导致的终末期肝病。目前虽然原位肝移植仍是治愈终末期肝衰竭的惟一方法,但肝移植费用很高,技术复杂,最关键的是受到供肝不足的限制。生物人工肝和肝细胞移植疗法可暂时辅助或部分代替严重病变的肝脏功能,清除体内各种有害物质,代偿肝脏相应的功能,从而使肝细胞得以再生直至自体肝脏功能恢复或等待机会进行肝移植,已成为替代肝移植和等待肝移植过渡治疗的极具吸引力的选择。但是,生物人工肝和肝细胞移植的临床应用同样受到肝细胞来源缺乏的限制。因为用于生物人工肝及肝细胞移植的理想肝细胞应具有以下特征:①人源性;②表型正常;③易于获得;④易于培养且能迅速生长至高密度;⑤具有良好的分化状态及成熟肝细胞的全部生物代谢功能。理论上,人原代肝细胞是最理想的细胞材料,但由于成人供肝来源极其有限且仅用于肝移植,加之成人肝细胞在体外增殖能力差,故大量获得成人肝细胞是不可能的。胎肝的利用因涉及伦理问题且同样来源受限,亦无法满足临床需要。使用动物肝细胞又存在发生免疫反应及传播动物病毒的危险。因此上述两种治疗方法在很大程度上依赖于人肝细胞系的发展。原代肝细胞在体外培养不但难以增殖传代,而且在一两周内迅速失去原有的肝细胞代谢功能。通过基因转移技术将猿猴病毒40大T抗原(simian virus 40 large T antigen, SV40T)等具有永生化作用的基因转到细胞中并稳定表达,可使细胞获得永生化同时保留一定的原代细胞特性。目前肝细胞永生化成为解决肝细胞来源的重要途径之一。本研究目的是应用携带SV40T基因的逆转录病毒表达载体pLNCTIGlox转导原代人胎肝细胞,建立永生化人胎肝细胞系,并对该细胞系的功能特性,永生化细胞的可回复性以及脾内移植预防90%肝切除小鼠肝衰竭的效果进行研究。方法1.用含新霉素耐药基因(NeoR)、SV40T和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的逆转录病毒表达载体pLNCTIGlox转染包装细胞PT67,获取病毒上清。用NIH3T3细胞滴定病毒滴度,免疫细胞化学染色检测上清感染的NIH3T3细胞中SV40T表达功能。2.体外两步灌流法分离孕20周龄人胎肝细胞,常规单层培养原代人胎肝细胞。3.用逆转录病毒表达载体pLNCTIGlox病毒上清感染原代培养的人胎肝细胞,用G418选择性培养,筛选成功转导的永生化细胞系。4.免疫细胞化学染色检测肝细胞特征蛋白的表达和SV40T蛋白的表达;糖原染色实验检测肝糖原合成情况;细胞计数法测定永生化细胞的增殖特性,绘制生长曲线。5.用放射免疫法和自动生化分析仪分别检测永生化细胞的白蛋白和尿素合成。6.用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析永生化细胞的肝细胞功能相关基因mRNA的表达。7.将4×10~6永生化细胞移植到严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠左腋下皮下,相同胎肝细胞移植到对侧作为对照,长期观察其是否形成肿瘤。8.采用90%肝切除术制备急性肝衰竭小鼠模型,小鼠分为4组:G1组经脾移植10~6永生化细胞,G2组移植10~6原代胎肝细胞,G3组移植10~6 HepG2细胞,G4组注射0.1ml DMEM。通过检测血氨和观察细胞移植后小鼠存活情况,评价永生化细胞移植对急性肝衰竭的治疗作用。9.用含Cre重组酶的逆转录病毒载体pQCXIP-NLS-iCre-ERT2转染包装细胞Phoenix A,产生病毒上清转导永生化细胞,建立含Cre-ERT2基因的可回复细胞系。10.用4-羟基-他莫昔芬(OHT)诱导Cre-ERT2重组酶活性,切除SV40T基因,免疫细胞化学染色和PCR法检测含Cre-ER基因的可回复永生化细胞受OHT诱导回复前后SV40T基因的表达和在基因组的整合情况。结果1.逆转录病毒载体pLNCTIGlox转染PT67细胞的病毒上清测得滴度为3×104CFU/ml。病毒上清感染的NIH3T3细胞经免疫细胞化学染色显示SV40T阳性,表明pLNCTIGlox逆转录病毒载体可成功转导和表达SV40T基因。2.体外两步灌流法分离孕20周龄人胎肝细胞,台盼蓝排斥法检测细胞活力约95%,分离出的肝细胞总数高达10~9个。3.逆转录病毒上清感染人原代胎肝细胞后用500μg/ml的G418筛选,连续选择培养14天获得5个具有G418抗性的具有上皮表型的细胞集落,经扩大培养后表型最接近原代肝细胞的1个细胞系命名为HepCL。4.免疫细胞化学染色检测HepCL肝细胞特征蛋白的表达,结果Alb、CK18、CK19和SV40T均为阳性,前三者胞浆着色,后者定位于胞核。糖原染色结果弱阳性。从细胞生长曲线计算出细胞系培养第十代的群体倍增时间约为0.7天。5.用特异性人白蛋白放射免疫试剂检测HepCL细胞培养上清中人白蛋白含量,生化仪检测其尿素氮含量,计算出HepCL细胞系平均白蛋白和尿素合成量分别为3.6pg/cell/d和0.22pmol/cell/d。6.永生化细胞系HepCL成瘤试验:连续观察16个月之久,在试验和对照侧移植处未见任何肿瘤形成。7. RT-PCR结果显示HepCL细胞表达肝实质细胞特异的白蛋白、细胞角蛋白CK8、CK18、肝细胞生长因子(HGF)受体、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、细胞色素P450 1B1(CYP450 1B1)和胆管上皮细胞特异的CK7、CK19、胆汁糖蛋白、γ-谷氨酰转肽酶。POU结构域转录因子八聚体结合蛋白4(Oct-4)和细胞周期调节因子p21也有表达。不表达转化生长因子受体Ⅱ型(TGF-βRⅡ)和Rex-1。8.急性肝衰竭SCID小鼠细胞移植结果显示:G1组(移植HepCL)和G2组(移植胎肝细胞)较G3组(移植HepG2细胞)和G4组(注射DMEM)受体小鼠的生存率大大提高;血氨水平显著降低;细胞移植两周后,在移植HepCL细胞和原代人胎肝细胞的小鼠肝内可观察到人白蛋白特异性染色阳性的肝细胞群。9.逆转录病毒载体pQCXIP-NLS-iCre-ERT2质粒DNA转染包装细胞Phoenix A,嘌呤霉素筛选获得稳定产病毒上清的细胞系,用HepG2细胞测得其病毒滴度为5×10~4CFU/ml。10.逆转录病毒载体pQCXIP-NLS-iCre-ERT2转导HepCL细胞获得稳定整合Cre-ERT2基因的Cre-HepCL细胞系。11. OHT诱导Cre-HepCL细胞系后,用免疫细胞化学染色法检测SV40T抗原,结果回复后细胞中仍有少数细胞有表达, Cre-HepCL细胞基因组仍可用PCR检测到SV40T基因存在,Cre-HepCL细胞未能100%回复。结论1.通过逆转录病毒载体pLNCTIGlox转导原代人胎肝细胞并使之表达SV40T基因,成功建立了具有肝细胞表型的永生化人胎肝细胞系HepCL。2.实验显示HepCL兼具肝实质细胞和胆管上皮细胞的表达特征,表达白蛋白、细胞角蛋白CK8、18、7、19, HGF受体、AAT、CYP450 1B1、GGT和胆汁糖蛋白,也表达Oct-4和p21,但不表达TGF-βRⅡ和Rex-1;致瘤实验阴性。3. HepCL细胞经脾移植给90%肝切除引起急性肝衰竭的SCID小鼠,可显著降低小鼠血氨水平,提高小鼠存活率,显示了较好的肝细胞移植疗效。4.通过逆转录病毒载体pQCXIP-NLS-iCre-ERT2转导HepCL细胞获得可用OHT介导的可回复永生化细胞系Cre-HepCL,但永生化细胞未能达到100%的回复率。