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球形芽胞杆菌(Bacillussphaericus,简称B.s)是一种广泛存在于自然界的革兰氏阳性菌,部分菌株对蚊幼虫的杀虫活性主要是由其在芽胞形成过程中产生的二元毒素决定的。其中,B.sC3-41作为一株对蚊幼虫具有特异性毒杀作用的高毒力菌株,广泛应用于我国蚊虫的生物防治中,取得了良好的应用防治效果。但其长期大量使用不可避免的带来蚊虫抗性,因此有必要鉴定筛选出新的杀虫活性因子以减缓抗性的发生和扩大杀虫谱。
Sphaericolysin是在对蚊幼虫无毒的B.sA3-2菌株中发现的一种胆固醇依赖溶细胞素(cholesterol-dependentcytolysins,CDCs),对德国小蠊(Blattelagermanica)及斜纹夜蛾(Spodopteralitura)幼虫具有一定的毒性作用。我们在B.sC3-41全基因组序列分析中也发现了sphaericolysin的编码基因,开展该基因及其编码蛋白的研究具有一定理论意义和实际应用价值。
本研究利用生物信息学技术,对sphaericolysin基因作了进化分析。结果表明,该基因与广义蜡样芽胞杆菌群的cereolysinO、炭疽芽胞杆菌CDC684菌株的anthrolysinO亲源关系较近,其次为蜂房芽胞杆菌的alveolysin；而与破伤风杆菌的tetanolysinO、蜡样芽胞杆菌的perfringolysinO、炭疽芽胞杆菌A0248、Ames、AmesAncestor及Sterne菌株的anthrolysinO的亲源关系较远。
PCR检测结果表明sphaericolysin基因广泛分布于有毒和无毒球形芽胞杆菌株中。PCR扩增片段的进化关系显示,有毒株来源的sphaericolysin基因相似性较高,而无毒株的相似性较低。对来源于高毒力菌株B.sC3-41的sphaericolysin基因进行克隆并在大肠杆菌中融合表达,发现重组菌株具有溶血活性,但对Vero细胞没有明显的致死或损伤作用。生物测定结果表明,重组菌株对蚊幼虫也没有明显的毒性作用。Westerblot检测发现,该基因在B.sC3-41中并没有表达,但在其他18株球形芽胞杆菌菌株中,除CIP5125,1593,IAB872,DaK614外均有表达。
本研究首次以来源于高毒力菌株.B.sC3-41的sphaericolysin基因为研究对象,完成了该毒素在球形芽胞杆菌中的PCR检测和westernblot检测,构建了大肠杆菌融合表达菌株,并对其表达产物进行了特性分析,为sphaericolysin毒素的进一步研究提供了基础。