目的:体外观察不同浓度犬富血小板血浆(PRP)对自体骨髓间充质细胞(MSCs)增殖、分化和mRNA表达的影响,初步评估PRP对MSCs的骨诱导作用,并得到最佳使用浓度,探讨组织工程学方法用于骨组织再生的可行性。 方法:利用二次离心法提取狗静脉血中的PRP,行血小板计数,激活制备富生长因子血清(serum rich in growth factors,SRGF),并与无血清D-MEM/F-12液配制得到1%、5%、10%、20%、30%共5个浓度的SRGF;利用密度梯度离心法提取培养狗MSCs并进行传代,每日观察并照相;利用四唑盐比色法(MTT法)观察不同浓度PRP(1%、5%、10%、20%、30%)于第1、3、5、7、9天共5个时间点对MSCs增殖的影响;用酶动力学法测定不同浓度PRP及rhBMP于第3、6、9、12天碱性磷酸酶(ALP)活性影响;对经PRP诱导后的MSCs用改良钙钴法行ALP染色,茜素红法行矿化结节染色,分7、14、21、28d4个时间点测量骨钙素(OCN)的含量;半定量RT-PCR法测定不同浓度PRP及rhBMP诱导后的MSCs中ALPmRNA及OCNmRNA水平。 结果:原代培养的骨髓间充质细胞24-48h开始贴壁,12d后细胞融汇成单层,细胞多呈成纤维梭形细胞形态,经PRP诱导后,细胞数目明显增多,形态渐变为方形、多角形,4-5天融成单层,8-10天形成多层细胞层;血小板记数显示PRP中血小板浓度为全血的5.38倍,含量达到要求;MTT法检测见各浓度PRP组均出现不同程度增殖,10%PRP组尤为显著;酶动力学法测定示各浓度PRP组ALP活性均较对照组增高,10%PRP组和rhBMP更为显著;MSCs经PRP诱导后,ALP染色强阳性;钙化结节增多;骨钙素表达量增高,有显著差异;经不同浓度PRP诱导后的MSCs经半定量RT-PCR分析见ALPmRNA及OCNmRNA水平均增高,其中以10%PRP组和rhBMP为显著。 结论:本实验中各浓度(1%、5%、10%、20%、30%)PRP均能有效的促使MSCs向成骨细胞分化,促进骨再生。其中以10%PRP为最佳浓度,可用来修复骨缺损,是组织工程骨研究的一个突破。