鸡传染性支气管炎（Avian infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Avian infectious bronchitis virus,IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触性、传染性呼吸道疾病,是世界禽类的主要呼吸道传染性疾病之一。IBV的S1蛋白是主要的免疫原性蛋白,目前,已有多篇利用S1蛋白免疫保护鸡并获得较好效果的研究报道。鸡慢性呼吸道病（Chronic respiratory disease,CRD）是由鸡毒支原体（Mycoplasma Gallisepticum,MG）感染引起的接触性、慢性呼吸道传染病。CRD主要引起产蛋鸡产蛋量下降,蛋的品质降低,饲料转化率降低,常给养鸡业带来巨大的经济损失。MG的TM-1蛋白为黏附宿主细胞的相关蛋白,已有研究证实该蛋白能够诱导机体对MG侵染产生免疫保护作用。目前,尚未发现利用S1基因和TM-1基因重组腺病毒二联基因工程疫苗的相关报道。本研究通过RT-PCR和PCR分别从IBV H52株和MG S6株中扩增出目的基因;将目的基因经T-A克隆至pMD19-T载体上,分别获得pMD-S1和pMD-TM-1;经酶切及测序鉴定后与穿梭载体pDC₃₁₅-EGFP连接,分别获得腺病毒重组穿梭质粒pDC₃₁₅-S1-EGFP、pDC₃₁₅-TM-1-EGFP、pDC₃₁₅-S1-TM-1-EGFP;利用脂质体转染法将重组腺病毒穿梭质粒与腺病毒大骨架pBH共转染HEK293细胞,经Western blot检测,获得表达S1基因和TM-1基因的重组腺病毒pBH-S1-TM-1-EGFP、pBH-S1-EGFP、pBH-TM-1-EGFP、pBH-EGFP;重组腺病毒纯化后,经TCID₅₀方法测定重组腺病毒的滴度,结果分别为10^10.875TCID₅₀/m L、10^11.750TCID₅₀/m L、10^10.625TCID₅₀/m L和10^12.250TCID₅₀/m L,符合后续动物试验所需的病毒滴度;通过测定重组腺病毒在不同时间的滴度,绘制其一步生长曲线,曲线显示重组腺病毒与腺病毒的生长特性基本一致;对第P4代、P8代、P10代、P15代重组腺病毒进行PCR检测,均含有插入的S1基因和TM-1基因,表明重组腺病毒的遗传稳定性良好,为下一步重组腺病毒二联疫苗动物试验奠定了研究基础。本研究目的是构建表达IBV S1基因和MG TM-1基因的重组腺病毒pBH-S1-TM-1-EGFP,阐明其生长特性和遗传稳定性,籍此为研制鸡传染性支气管炎和鸡毒支原体的二联基因工程载体疫苗奠定基础。