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肝癌(HCC)是在临床中最为常见的恶性肿瘤之一。在中国,肝癌的形势十分严峻,其发病人数和死亡人数均位列世界首位。目前临床上的肝癌治疗方式有手术治疗、介入治疗、化疗、放疗等,但由于早期肝癌没有明显症状,多数患者不能及时察觉就医,当确诊时病情已经发展为中晚期肝癌,错过了进行手术治疗的时机,此时化疗为主要治疗手段。目前,肝癌对化疗药物已经出现严重的耐药现象,造成肝癌化疗效果不理想。肝癌化疗时,必须预防和逆转肝癌耐药,但目前仍然没有有效预防和逆转肝癌耐药的手段。因此阐明肝癌耐药的机制,寻找有效的干预靶点以提供有效的干预手段,是提高肝癌化疗效果的关键。肿瘤细胞外酸性微环境是实体瘤的主要特征之一,这是由于肿瘤组织缺氧和血流灌注不足、肿瘤细胞高水平的糖酵解引起的。已有研究发现,肿瘤细胞外酸性微环境能够介导肿瘤耐药。但是,这种酸性信号如何传递到细胞内,又如何介导肿瘤耐药呢?ASIC1a是酸敏感离子通道(ASICs)的一个亚基,其作为细胞膜上的酸感受器,在细胞外酸性环境中被激活,进而将细胞外低pH值的信号传递到细胞内。已有研究发现,ASIC1a能够紧密参与到肿瘤的发生发展过程。那么,肿瘤细胞外酸性微环境是否是通过激活ASIC1a,从而将酸性信号传递到细胞内,进一步介导肝癌耐药呢?因此,本课题组探究肿瘤细胞外酸性微环境是否通过激活ASIC1a介导肝癌耐药及其机制。目的:本实验采用两种人肝癌耐药细胞株bel7402/fu,hepg2/adm以及人肝癌组织,检测asic1a在肝癌耐药细胞以及人肝癌组织中的表达情况,进一步探讨在酸性环境中,asic1a是否介导肝癌耐药,以及asic1a是否通过介导ca2+内流激活pi3k/akt信号通路,进而诱导肝癌耐药。方法:1.采用westernblotting法检测asic1a在8对癌旁组织和人肝癌组织中的表达水平。2.采用westernblotting法检测asic1a在人肝癌耐药细胞bel7402/fu和hepg2/adm中的表达情况。3.采用mtt法分别检测人肝癌耐药细胞bel7402/fu对5-fu的耐药性以及人肝癌耐药细胞hepg2/adm对阿霉素的耐药性。4.使用25、100、400μΜ阿米洛利抑制asic1a,作用3、6、12、24、48h后,采用mtt法分别检测人肝癌耐药细胞bel7402/fu对5-fu的化学敏感性以及人肝癌耐药细胞hepg2/adm对阿霉素的化学敏感性。5.使用25、100、400μΜ阿米洛利抑制asic1a,作用24、48h后,采用集落形成分析分别检测人肝癌耐药细胞bel7402/fu对5-fu的化学敏感性以及人肝癌耐药细胞hepg2/adm对阿霉素的化学敏感性。6.使用携带asic1ashrna的慢病毒感染人肝癌耐药细胞bel7402/fu和hepg2/adm,构建asic1a基因沉默株。随后采用westernblotting法检测慢病毒感染后的人肝癌耐药细胞bel7402/fu和hepg2/adm中asic1a的表达情况,以筛选构建成功的沉默株。7.采用mtt法分别检测人肝癌耐药细胞bel7402/fu-shrna对5-fu的化学敏感性以及人肝癌耐药细胞hepg2/adm-shrna对阿霉素的化学敏感性。8.使用25、100、400μΜ阿米洛利处理bel7402/fu-shrna和hepg2/adm-shrna细胞,作用24、48h后,采用mtt法分别检测bel7402/fu-shrna对5-fu的化学敏感性和hepg2/adm-shrna对阿霉素的化学敏感性。9.使用携带asic1a基因的慢病毒感染人肝癌细胞bel7402和hepg2,构建asic1a基因过表达株。随后采用westernblotting法检测慢病毒感染后的人肝癌细胞bel7402和hepg2中asic1a的表达情况,以筛选构建成功的过表达株。10.采用mtt法分别检测人肝癌细胞bel7402-asic1a对5-fu的化学敏感性以及人肝癌细胞hepg2-asic1a对阿霉素的化学敏感性。11.使用25、100、400μΜ阿米洛利处理bel7402-asic1a和hepg2-asic1a细胞,作用24、48h后,采用mtt法分别检测bel7402-asic1a对5-fu的化学敏感性和hepg2-asic1a对阿霉素的化学敏感性。12.使用钙离子荧光探针fluo-3am标记人肝癌耐药细胞bel7402/fu和hepg2/adm中的钙离子,随后采用流式细胞术检测细胞内的钙离子水平。13.使用钙离子荧光探针fluo-3am标记人肝癌耐药细胞bel7402/fu和hepg2/adm中的钙离子,随后应用激光共聚焦显微镜检测asic1a是否介导钙离子内流。14.采用westernblotting法检测bel7402/fu-shrna和hepg2/adm-shrna细胞中pi3k和p-akt的表达情况。15.采用westernblotting法检测pi3k与p-akt在人肝癌耐药细胞bel7402/fu和hepg2/adm中的表达情况。随后分别使用wortmannin和mk-22062hcl抑制pi3k/akt通路后,采用mtt法分别检测人肝癌耐药细胞bel7402/fu对5-fu的化学敏感性以及人肝癌耐药细胞hepg2/adm对阿霉素的化学敏感性。结果:1.与癌旁组织相比,asic1a在人肝癌组织中的表达量显著增加。2.与人正常肝细胞l-02、人肝癌细胞bel7402或hepg2相比,asic1a在人肝癌耐药细胞bel7402/fu或hepg2/adm中的表达明显增加。3.抑制asic1a活性能够明显增强bel7402/fu对5-fu的化学敏感性以及hepg2/adm对阿霉素的化学敏感性。4.沉默ASIC1a基因能够明显增强Bel7402/FU对5-FU的化学敏感性以及HepG2/ADM对阿霉素的化学敏感性。5.过表达ASIC1a基因能够明显增强Bel7402对5-FU的耐药性以及Hep G2对阿霉素的耐药性。6.与人正常肝细胞L-02、人肝癌细胞Bel7402或HepG2相比,钙离子水平在人肝癌耐药细胞Bel7402/FU或HepG2/ADM中明显增加。7.在人肝癌耐药细胞Bel7402/FU和HepG2/ADM中,ASIC1a能够介导钙离子内流。8.沉默ASIC1a基因能够抑制PI3K/AKT信号通路。9.抑制PI3K/AKT信号通路能够明显增强Bel7402/FU对5-FU的化学敏感性以及HepG2/ADM对阿霉素的化学敏感性。结论:1.ASIC1a能够介导人肝癌耐药。2.ASIC1a通过调控Ca2+/PI3K/AKT信号通路诱导人肝癌耐药。