目的：缺血性脑血管病是临床上常见病、多发病之一，死亡率和致残率均较高，严重危害着人类的健康。特别是神经细胞对缺血性损害非常敏感，长时间的缺血打击使得神经细胞大量死亡，难以再生，从而留下许多严重甚至是不可逆性的后遗症。因此，调动机体的内源性保护机制，提高神经细胞对缺血性损害的抵抗力，使其在蒙受较严重的缺血状态下减轻损伤，保持存活，保证恢复血液供应后这些神经细胞仍具有正常生理功能，是缺血性脑血管病治疗上的一个重要策略。1990年，日本学者Kitagiwa等首先发现，预先给予沙土鼠轻微、短时、不致引起神经元死亡的脑缺血，可减轻再次损伤性缺血引起的CA1区神经元死亡，此种现象称为脑缺血耐受（brain ischemic tolerance），提前给予的亚致死性脑缺血称为脑缺血预处理（brain ischemic preconditioning）。但是，这种操作很难作为一种脑缺血前的预防措施进入临床应用，因此人们不断探索新的有效的脑缺血预处理措施。研究表明，应用药物模拟或诱导一些物质如腺苷、HSP等的表达，可使神经细胞对缺血性损伤产生对抗作用。　　 热休克蛋白（heat shock protein，HSP）亦称应激蛋白，是在生理或病理应激状态下于细胞内诱导合成的蛋白质，对应激细胞起保护作用。其中分子量为70kd的HSP家族是最保守的HSP，其在正常细胞中水平较低，应激状态下显著升高，因而成为HSPs中最被关注、研究最深入的一种。作为非器官特异性应激蛋白，HSP70可能有助于神经元缺血耐受的形成。　　 恩必普（Butylphhtalide或Dinbente，简称NBP）即消旋-3-正丁基苯酞软胶囊是我国成功制出具有自主知识产权的治疗急性缺血脑卒中的一类化学新药。本实验应用大鼠四血管闭塞全脑缺血模型，观察恩必普预处理对全脑缺血-再灌注引起的海马CA1区神经元迟发性死亡的影响，探讨恩必普预处理的脑保护作用。在此基础上，进一步观察恩必普预处理后全脑缺血大鼠海马CA1区HSP70的表达情况，以及应用HSP70合成抑制剂槲皮素对海马CA1区神经元迟发性死亡的影响，探讨HSP70在恩必普预处理抗脑缺血再灌注损伤中的作用及恩必普脑保护作用的可能机制。　　 方法：　　 1、恩必普预处理对大鼠全脑缺血再灌注引起的海马锥体神经元迟发性死亡的影响　　 应用大鼠四血管闭塞全脑缺血模型，36只大鼠椎动脉凝闭后随机分为4组：①Sham组（n=6）：游离双侧颈总动脉，但不夹闭；②恩必普预处理组（n=6）：恩必普30mg/kg灌胃；③脑缺血组（n=6）：夹闭双侧颈总动脉8 min致全脑缺血；④恩必普预处理+脑缺血组：恩必普预处理后即刻、1d和2d行8min全脑缺血（共3组，每组n=6）。所有大鼠在sham手术或末次缺血再灌后7天，断头取脑，硫堇染色确定海马CA1区组织学分级（histological grade，HG）和神经元密度（neuronal density，ND），以反映迟发性神经元死亡（delayed neuronal death，DND）情况。　　 2、恩必普预处理对缺血再灌注海马HSP70表达的影响　　 应用大鼠四血管闭塞全脑缺血模型，90只椎动脉永久凝闭的大鼠随机分为3组。（1） sham组：下设五个亚组：分别为脑缺血sham手术后6h、12h、1d、3d、5d组（每组n=6）。（2）脑缺血组：全脑缺血8 min。下设五个亚组：分别为脑缺血后6h、12h、1d、3d、5d组（每组n=6）。（3）恩必普+脑缺血组：恩必普预处理1d后行全脑缺血8 min；下设五个亚组：分别为脑缺血后6h、12h、1d、3d、5d组（每组n=6）。所有动物于规定时间点断头取材，石蜡包埋，连续切片，免疫组织化学染色观察大鼠海马CA1区HSP70的表达。　　 3、HSP70抑制剂Quercetin对恩必普预处理的脑保护作用的影响　　 应用大鼠四血管闭塞全脑缺血模型，36只椎动脉永久凝闭的大鼠随机分为以下6组：（1） sham组行脑缺血sham手术（n=6）；（2）恩必普预处理组：恩必普灌胃30mg/kg（n=6）；（3）脑缺血组：行全脑缺血8 min；（4）恩必普预处理+脑缺血组：恩必普预处理后1d行全脑缺血8 min；（5） Quercetin+恩必普+脑缺血组：恩必普预处理前30min及恩必普预处理后即刻、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d分别给与HSP70抑制剂Quercetin（50 mg/kg，腹腔注射），其余同恩必普预处理+脑缺血组；（6） DMSO+恩必普+脑缺血组：腹腔注射3％的DMSO溶液4 mL/kg，注射时间及其它处理同Quercetin+恩必普+脑缺血组。所有动物均于末次手术后7天断头取材，硫堇染色确定海马CA1区组织学分级（histological grade，HG）和神经元密度（neuronal density，ND），以反映迟发性神经元死亡（delayed neuronal death，DND）情况。　　 结果：　　 1、恩必普预处理减轻大鼠全脑缺血再灌注损伤引起的海马CA1区锥体神经元迟发性死亡　　 硫堇染色结果表明sham组和恩必普组大鼠海马CA1区无明显损伤，组织学分级（histological grade，HG）为0～Ⅰ级，ND分别为193±8.6（cells/mm，下同）、196.8±12。脑缺血组大鼠海马CA1区有明显组织损伤；HG为Ⅱ～Ⅲ级，ND为34.8±8.2，与sham组和恩必普组相比，HG明显升高，ND明显减少（p<0.01）。在恩必普预处理+脑缺血组，恩必普预处理后1d脑缺血再灌注海马CA1区锥体细胞排列整齐致密，胞核饱满，核仁较清晰，仅个别锥体细胞胞核固缩，无明显细胞缺失，与脑缺血组相比，HG（Ⅰ级）明显降低，ND（165.3±9.3）明显升高，表明恩必普预处理对其后1d发生的脑缺血再灌注损伤有明显的对抗作用。恩必普预处理后即刻和2d进行脑缺血再灌注，与脑缺血组比较，HG有一定程度降低，ND有一定程度升高（p<0.01），但大鼠海马CA1区锥体细胞缺失较多，仍有明显的组织损伤。　　 结果表明恩必普预处理能够减轻大鼠全脑缺血再灌注损伤引起的海马CA1区锥体神经元迟发性死亡，这种作用在恩必普预处理后1d最为强大，而在预处理后即刻及2d对脑缺血再灌注损伤虽有一定的抑制作用，但作用强度明显减弱。　　 2、恩必普预处理上调脑缺血再灌注大鼠海马CA1区HSP70表达　　 HSP70阳性表达产物为棕黄色颗粒，多见于神经元胞浆和轴突，有时可见于胞核。sham组海马神经元中少见明显的HSP70蛋白表达。单纯脑缺血组，CA1区于再灌注各时间点可见少量HSP70阳性表达；在CA3、CA4区及齿状回区可见大量HSP70阳性表达。在恩必普+脑缺血组，脑缺血再灌注6h海马CA1区可见少量的HSP70表达，12hHSP70表达增加，再灌注1d后CA1区HSP70表达明显增强，数量增加，达到高峰，可见大量神经元的胞浆及轴突呈棕黄色HSP70阳性染色；再灌注3d后CA1区HSP70表达维持在较高水平，但与1d组相比较已开始回落；再灌注5d仍可见到CA1区少量HSP70阳性表达。与sham组及TCI组相应时间点比较，再灌注后12h、1d、3d、5d海马CA1区阳性细胞数、阳性细胞总面积和平均光密度明显增加，差异有统计学意义（P<0.01）。恩必普预处理后脑缺血再灌注各个时间点海马CA3区锥体细胞和齿状回颗粒细胞HSP70阳性表达的情况与脑缺血各组相似。　　 结果表明，恩必普预处理能够上调脑缺血再灌注大鼠海马CA1区HSP70表达，HSP70表达在1d达到高峰。　　 3、HSP70抑制剂Quercetin能够抑制恩必普预处理的脑保护作用　　 硫堇染色结果显示，sham组和恩必普预处理组大鼠海马CA1区无明显的DND，HG为0～Ⅰ级，ND分别为200.2±5.1、201.3±5.4。脑缺血组大鼠海马CA1区出现明显的组织损伤，与sham组和恩必普预处理组比较，HG（Ⅱ-Ⅲ级）明显升高，ND（44.3±8.3）显著降低。恩必普预处理+脑缺血组中，海马CA1区未见明显细胞损伤，与脑缺血组相比，其HG（1级）明显降低，ND（157±6.9）值明显升高，表明恩必普预处理可诱导产生脑缺血耐受，减轻脑缺血再灌注引起的海马CA1区锥体神经元DND。给予3％DMSO对恩必普诱导的脑缺血耐受无明显影响，其HG和ND与恩必普预处理+脑缺血组相近。然而，给予HSP70合成抑制剂Quercetin则明显阻断了恩必普的脑保护作用，在海马CA1区出现了明显的DND，与恩必普预处理+脑缺血组相比，其HG明显升高（Ⅱ-Ⅲ级），ND值明显降低（122.8±8.2）。　　 结果表明，恩必普预处理后能够诱导大鼠海马CA1区脑缺血耐受，HSP70抑制剂Quercetin可以阻断这种保护作用。　　 结论：　　 1.恩必普预处理能够诱导大鼠海马CA1区脑缺血耐受；　　 2.恩必普预处理能够上调脑缺血再灌注大鼠海马CA1区HSP70的表达；　　 3.应用HSP70抑制剂Quercetin可以阻断恩必普预处理诱导的大鼠脑缺血耐受；　　 4.综上，HSP70参与恩必普预处理诱导的大鼠脑缺血耐受。