论文部分内容阅读
苍术（Atractylodes lancea）和厚朴（Magnolia officinalis）为传统芳香化湿类中药。现代研究表明苍术、厚朴及其有效成分具有抗氧化、抗炎、改善胰岛素抵抗和肾损伤的药理作用,但其中的作用机制尚需进一步阐明。本论文将初步分析苍术、厚朴及其配伍水提取物成分和网络药理学,从胰岛素信号通路角度,探究苍术、厚朴及其配伍的肾保护作用和潜在的分子机制。本文通过液相色谱-串联质谱（LC/MS）分析,分别从苍术、厚朴及其配伍的水提取物中初步鉴定出31、18、55个化合物。应用网络药理学研究预测这些化合物的潜在作用靶点,并对靶点相关的代谢通路进行富集,初步结果显示苍术、厚朴及其配伍水提取物可能参与调节肾脏胰岛素信号通路,而苍术与厚朴配伍影响肾脏胰岛素信号通路的程度可能比苍术、厚朴单独用药大。为此,本文在课题组前期已建立的高果糖诱导大鼠肾损伤模型上,研究苍术、厚朴及其配伍对胰岛素抵抗、肾脏胰岛素信号通路和肾功能变化等的影响。与模型组比较,苍术、厚朴及其配伍水提取物可提高模型大鼠葡萄糖耐量和胰岛素敏感性,降低血清尿酸、肌酐、尿素氮、胰岛素水平及尿蛋白肌酐比,上调肾小球nephrin蛋白表达水平。这些结果表明苍术、厚朴及其配伍可减轻高果糖诱导的大鼠系统性胰岛素抵抗、肾小球损伤,减少蛋白尿,且苍术和厚朴具有良好的配伍效应。足细胞是肾小球滤过屏障上唯一的胰岛素敏感细胞,足细胞标志蛋白nephrin水平也受胰岛素信号通路的影响。在模型大鼠肾小球和体外足细胞中均观察到胰岛素信号通路关键蛋白如磷酸化胰岛素底物受体（p-IRS1）、胰岛素底物受体（IRS1）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、脂联素受体1（Adipo R1）以及nephrin较正常组显著下调,提示肾小球足细胞胰岛素信号通路受损。与模型组比较,苍术、厚朴及其配伍水提取物可上调模型动物肾小球和体外足细胞p-IRS1、IRS1、p-Akt、Adipo R1和nephrin蛋白水平。这些结果表明苍术、厚朴及其配伍能减轻高果糖诱导的肾小球足细胞胰岛素信号通路受损。为进一步探究高果糖诱发足细胞胰岛素信号通路受损的可能分子机制,选取网络药理学分析与胰岛素抵抗通路相关,且在苍术和厚朴配伍水提取物的靶点蛋白中更显著富集的去乙酰化酶Sirtuin1（Sirt1）蛋白进行研究。使用Sirt1抑制剂EX527、激动剂白藜芦醇分别在体外干预正常和模型足细胞。与正常组比较,经果糖刺激后足细胞Sirt1显著下调;而高果糖、EX527均能引起足细胞胰岛素信号受损和nephrin蛋白表达水平降低。与模型组比较,白藜芦醇可逆转高果糖诱导的足细胞胰岛素信号通路受损和nephrin蛋白表达水平的下调,这些研究结果提示高果糖可能通过抑制Sirt1促进足细胞胰岛素信号通路受损和足细胞损伤。Sirt1可去乙酰转录因子p53,抑制其转录因子活性。本文利用免疫共沉淀（CoIP）实验,在体外足细胞上验证了Sirt1对p53蛋白382位Lys的去乙酰化作用。使用p53激动剂Nutlin-3（Nut-3）、抑制剂Pitithrin-α（PTF-α）分别干预正常足细胞和模型足细胞。与正常组比较,高果糖模型组足细胞p53乙酰化水平显著上升;而高果糖、Nut-3均引起足细胞胰岛素信号通路受损,并降低nephrin蛋白表达水平。与模型组比较,PTF-α可逆转高果糖引起的足细胞胰岛素信号受损和nephrin蛋白表达水平的下降。这些实验结果提示高果糖可能通过促进p53活性引起足细胞胰岛素信号通路受损并损伤足细胞。另外,染色质免疫共沉（Chip）实验结果发现p53可结合在Micro RNA-221（mi R 221）启动子的三个结合位点上,可能促进mi R-221的转录。与此一致的是,与正常组比较,高果糖模型足细胞mi R-221表达水平呈现显著上调;而高果糖、转染mi R-221 mimic均可引起足细胞胰岛素信号受损和nephrin蛋白表达水平的下降。与模型组比较,mi R-221inhibitor可逆转上述变化,提示高果糖也可能通过上调mi R-221表达而损害足细胞胰岛素信号并促进足细胞损伤。在本文研究中还观察到mi R-221高表达可显著地降低足细胞胰岛素信号关键蛋白IRS1和Adipo R1表达。荧光素酶报告基因实验显示mi R-221通过靶向结合在IRS1和Adipo R1的3’UTR区抑制IRS1和Adipo R1蛋白表达,使胰岛素信号受损。这些研究结果提示高果糖抑制Sirt1表达,促进p53乙酰化和mi R-221表达上调,抑制IRS1和Adipo R1表达,从而引起足细胞胰岛素信号受损和足细胞损伤。为进一步探究苍术、厚朴及其配伍是否通过Sirt1/p53/mi R-221减轻肾小球足细胞胰岛素信号通路受损,在上述动物和细胞模型上分析它们对Sirt1、p53、Ac-p53和mi R-221水平的影响。与模型组比较,苍术、厚朴及其配伍的水提取物可有效逆转高果糖引起的大鼠肾小球和体外足细胞Sirt1的下调、以及p53、Ac-p53和mi R-221的上调,这与苍术、厚朴及其配伍在减轻模型动物肾小球和体外足细胞胰岛素信号通路受损的结果一致,提示苍术、厚朴及其配伍可能通过调节Sirt1/p53/mi R-221通路,恢复胰岛素信号通路转导,从而逆转高果糖引起的肾小球足细胞损伤。小结:本文研究表明苍术、厚朴及其配伍可能通过调节Sirt1/p53/mi R-221通路从而减轻高果糖引起的肾小球足细胞胰岛素信号受损,保护肾小球足细胞,降低蛋白尿。这些研究结果为苍术、厚朴及配伍临床有效治疗肾小球足细胞损伤相关疾病提供实验依据。