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重组病毒样颗粒(Virus-likeparticle,VLP)作为高度模拟天然病毒形态的生物纳米颗粒,是由某种病毒的一种或多种结构蛋白通过有规律的聚集组装形成的高度有序和具有多重对称的空心颗粒,不携带核酸等遗传物质。VLP可进行类似天然病毒颗粒的解聚和自组装过程,通过和病毒感染机体一样的途径递呈免疫细胞,进而有效地刺激并诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应。因此,关键表位完整性的分析将为疫苗研发的设计以及工艺发展过程的改进提供数据支持和参考,对于VLP疫苗研发及其临床应用具有重要意义。本研究针对两种VLP疫苗(乙肝疫苗,宫颈癌疫苗)关键表位定量分析研究,旨在提出具有通用意义的VLP疫苗表位定量分析方法。首先,本研究采用构象敏感性分析(rEC50),定量测定单抗亲和活性(EC50),单抗分型鉴定等方法对anti-HBsAg、anti-HPV16、anti-HPV18单抗盘进行性质鉴定,获得代表性单抗(HBs-42B6、HBs-5F11;HPV16-1D12、HPV16-8A9;HPV18-3C3、HPV18-13H12)。通过假病毒中和实验,自然感染者血清阻断实验,疫苗免疫者血清阻断实验,型特异分析等实验验证代表性单抗生物学功能活性,其中5F11为高中和活性anti-HBsAg单抗,检测单抗8A9,3C3分别为HPV16,HPV18优势中和单抗。其次,本研究利用代表性单抗建立关键表位完整性定量分析方法:建立HBsAgVLP 的双抗夹心系统(“MassELISA”42B6:Ag:42B6-HRP、“Antigenicity ELISA”42B6:Ag:5F11-HRP),实验方法重复性良好,RSD<10%;建立 HPV16双抗夹心 ELISA(1D12:Ag:8A9-HRP)、HPV18 双抗夹心 ELISA(13H12:Ag:3C3-HRP),实验重复性良好,RSD<10%。建立HPV16竞争ELISA分析方法(1D12、8A9、PD1)、HPV18 竞争 ELISA 分析方法(13H12、3C3、11A9)。最后,利用本研究建立的分析方法对VLP关键表位完整性定量分析:双抗夹心 ELISA 系统("mass ELISA" 42B6:Ag:42B6-HRP,"antigenicity ELISA"42B6:Ag:5F11-HRP)定量分析VLP关键表位的二硫键氧化还原时的抗原性变化,结合浊度扫描方法考察HBsAg VLP与HBsAg VLP(10 mM DTT)热稳性,证实二硫键是HBsAgVLP抗原性和热稳定的关键影响因素;通过双抗夹心ELISA系统和竞争ELISA方法定量分析HPV16 VLP,HPV18 VLP关键表位丢失,结合浊度扫描和DSC方法考察HPV16 VLP与HPV16 VLP(0.01%硫柳汞)、HPV18VLP与HPV18VLP(0.01%硫柳汞)热稳定,证实硫柳汞特异结合VLP游离半胱氨酸会导致VLP热稳定下降,说明关键表位完整性不仅是疫苗发挥效力的重要保证,也是疫苗热稳定性的关键因素。综上所述,本研究成功建立定量分析HBsAg,HPV16,HPV18三种VLP的不同方法。本研究针对三种不同VLP抗原的单抗盘进行分析,包括抗体抗原亲和力排序,表位破坏评估单抗构象敏感性等方法。更重要的是,通过中和实验和血清阻断实验验证代表性单抗生物学功能活性,确定代表性单抗作为疫苗抗原性定量分析工具的有效性,为疫苗质量分析提供分子探针。基于代表性单抗开发的不同免疫化学方法为生产工艺控制和产品可比性分析实验提供不同的工具箱,为疫苗质量分析提供参考和思路。