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研究背景与目的严重烧伤后易出现免疫功能紊乱,既往研究证实高迁移率族蛋白B1及白介素35在多原因导致的免疫功能紊乱发病机制中起重要作用。高迁移率族蛋白B1 (HMGB1)是烧伤后重要的晚期炎症介质和经典的损伤相关分子(DAMPs)。HMGB1一方面参与炎性细胞的聚集和组织的修复,另一方面也能激活免疫功能细胞分泌TNF、IL-1和其它促炎因子,并引起血管通透性增加、发热等病理生理反应。此外HMGB1还能促使T细胞亚群分化由Th1向Th2漂移,并可以促进调节性T细胞(Treg)表面分子的成熟。既往研究发现,严重烧伤后主要组织HMGB1表达广泛、增高较晚,且持续时间长。临床资料显示,严重烧伤第1天患者血浆HMGB1含量明显升高,并且其水平与严重脓毒症病理过程密切相关。因此HMGB1在烧创伤、感染、脓毒症等病理生理过程中扮演着重要角色,被认为是烧创伤引起脓毒症的潜在治疗靶点。严重烫伤动物血清中的HMGB1表达水平升高,与脾脏Treg表面标志分子表达上调、免疫抑制功能增强有关。白介素35(IL-35)作为与Treg免疫抑制功能密切相关的新型细胞因子,在Treg的分化和发育中都不可或缺。IL-35由IL.12 α(即p35)和EB13两个亚基构成,在Treg的亚群(iTr35)、调节性B细胞(Breg)、CD8阳性调节性T细胞(CD8+Tregs)、髓源性免疫抑制细胞(MDSC)等免疫细胞表达。Treg可通过IL-35调控Th1、Th2和Th17等效应T细胞的分化,如IL-35可将T细胞中Thl细胞周期阻滞于G1期以抑制Thl增殖,或可通过抑制Th17表面受体表达,抑制Th17功能,从而相对增强Th2的功能。严重烫伤后HMGB1是否会影响效应细胞对IL-35的表达,继而影响T淋巴细胞分化及免疫功能,尚未见文献报道。本实验通过建立小鼠烫伤模型。采用实时荧光定量核酸扩增检测系统(Q-PCR)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)等动态检测了小鼠烫伤后72 h内其心、肝、脾、肺组织及脾脏单个核细胞中HMGB1和IL-35的表达以及脾脏淋巴细胞功能的变化。通过腹腔注射HMGB1的特异性拮抗剂Abox拮抗小鼠体内HMGB1的主动分泌和被动释放,进一步检测此条件下,实验小鼠体内各脏器组织IL-35表达变化及脾脏淋巴细胞功能的改变。试图了解小鼠烫伤后HMGB1对其脏器组织IL-35的表达及脾脏淋巴细胞功能变化的影响,为改善严重烧伤后机体免疫抑制状态提供新的思路。目的观察小鼠烫伤后心、肝、脾、肺组织及脾脏单个核细胞中HMGB1和IL-35的表达变化,并探讨HMGB1对脏器组织细胞表达IL-35及脾脏T淋巴细胞免疫功能的影响。方法选择成年、雄性BALB/c小鼠,称重后随机分为：空白组、假伤组、烫伤组、Abox干预组。乙醚吸入性麻醉后常规制作小鼠背部15%TBSA烫伤模型。烫伤组和干预组小鼠烫伤后0、12 h给予补液抗休克。干预组烫伤后2 h和12 h分别给予HMGB1特异性拮抗剂Abox腹腔注射(300 μg/只)。于伤后24、48、72 h取材,留取心、肝、脾、肺等组织,组织匀浆后,分别提取RNA和组织总蛋白；qPCR法测定IL-35亚基p35和EBI3 mRNA表达,ELISA法测定各组织、脾脏单个核细胞中HMGB1和IL-35蛋白表达。另将脾脏组织分离出脾脏单个核细胞,并用贴壁法分离部分脾脏单个核细胞中的T细胞,cck8法检测T细胞增殖活性；并取T细胞上清测定IL-2、IFN-γ、IL-4含量。使用SPSS16.0软件对各组数据进行统计学处理。数据采用均数±标准差(x±s)表示；资料满足正态分布时,采用两独立样本t检验；组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。结果1小鼠烫伤后脏器组织HMGB1及IL-35表达变化正常小鼠(空白组)心、肝、脾、肺组织及脾脏单个核细胞HMGB1蛋白和IL-35亚基(P35及EBI3) mRNA和蛋白表达均有表达。与空白组比较,假伤组肝、脾、肺组织及脾脏单个核细胞HMGB1蛋白表达无差异(P>0.05),而假伤组心脏组织HMGB1蛋白表达高于空白组(P<0.05)；假伤组心、肝、脾组织及脾脏单个核细胞于48 h内P35及EBI3 mRNA水平高于空白组(P<0.05),肺组织P35及EBI3 mRNA无明显差异(P>0.05)；假伤组肝、脾、肺组织及脾脏单个核细胞于72内IL-35蛋白表达与空白组无差异,心脏组织IL-35蛋白表达高于空白组(P<0.05)。与空白组与假伤组比较,烫伤组伤后24、48、72 h小鼠心、肝、脾脏组织中HMGB1蛋白、P35、EBI3 mRNA及IL-35蛋白水平明显升高(P<0.01),而肺脏组织中P35、EBI3 mRNA及IL-35蛋白水平明显下降。2 Abox干预对烫伤小鼠组织HMGB1表达的影响与假伤组与空白组比较,烫伤组各脏器HMGB1表达在烫伤后24h显著上升(P<0.01),并在24-48h维持在高水平,烫伤72h后逐渐下降。与烫伤组比较,Abox干预组伤后24、48 h小鼠心、肝、脾、肺组织HMGB1含量及脾脏单个核细胞HMGB1表达均明显下降(P<0.01)。3 Abox干预对烫伤小鼠体内IL-35表达水平的影响3.1 IL-35 mRNA表达：与假伤组比较,烫伤组小鼠各脏器IL-35亚基p35mRNA表达均明显提高。其中以脾脏变化最明显,肺脏变化最小,在伤后48h、72h,肺脏p35mRNA表达水平与假伤组无差异。亚基EBI3 mRNA表达水平均升高(P<0.05)以肝脏变化最大,肺脏变化最小,在伤后48h与72h组,肺脏EBI3mRNA表达水平与假伤组无差异。使用Abox干预后24h,烫伤小鼠各脏器中IL-35两亚基的表达水平均明显下调(P<0.01)。干预后48h,肺脏两亚基mRNA表达水平差异无统计学意义。3.2 IL-35蛋白水平变化：与假伤组比较,烫伤后24h心脏、肝脏、脾脏组织中IL-35蛋白含量及脾脏单个核细胞IL-35的分泌量均较假伤组升高(P<0.01),以脾脏变化最大。而烫伤后24h肺组织IL-35蛋白表达水平出现下降(P<0.01)。Abox干预后小鼠心脏、肝脏、脾脏组织和脾脏单个核细胞IL-35蛋白水平均明显下降(P<0.01)。肺组织IL-35变化趋势与其它组织相反,Abox干预后其含量明显上升。4 Abox干预对烫伤小鼠脾脏T细胞免疫功能的影响4.1 IFN-y及IL-4分泌水平：与假伤组比较,烫伤组T淋巴细胞分泌的IFN-γ及IL-4含量于伤后24、48 h明显升高(P<0.01),72 h降低至假伤组水平(P>0.05)。与烫伤组比较,Abox干预后,伤后24、48h IFN-γ更明显升高,IL-4明显降低,因此Abox干预组IFN-γ/IL-4比值较烫伤组明显升高(P<0.01)。4.2 T淋巴细胞增殖活性：与假伤组比较,烫伤组的T淋巴细胞增殖活性及其细胞因子IL-2含量显著降低。Abox干预后,T细胞增殖活性,T淋巴细胞增殖活性及其细胞因子IL-2含量较烫伤组显著升高(P<0.01)。结论正常小鼠心、肝、脾、肺组织及脾脏单个核细胞HMGB1蛋白和IL-35亚基(P35及EBI3) mRNA和蛋白表达均有表达。小鼠烫伤后,心、肝、脾组织中IL-35亚基(P35及EBI3) mRNA表达水平及IL-35蛋白水平明显升高,而肺组织中P35及EBI3 mRNA及IL-35蛋白水平明显下降。Abox可有效的降低烫伤小鼠心、肝脏、脾组织及脾脏单个核细胞对HMGB1、P35和EBI3 mRNA及IL-35蛋白的表达；促进脾脏T细胞增殖,以及Th2为主的效应T细胞向Thl为主的转化,增强Thl细胞的功能,从而有助于改善严重烧伤后免疫抑制状态。