目的:肺癌已成为全球发病率、致死率最高的恶性肿瘤。近几年来,世界各国肺癌的发病率和死亡率都有升高,每年新发肺癌超过百万,我国肺癌的发病率已高达61.4/10万,到2015年,我国将成为世界第一肺癌大国。尽管肺癌的化学治疗、放射治疗、分子靶向治疗等技术不断发展,肺癌治疗的总体疗效仍然很差。生物反应调节剂（biology response modulation BRM）作为肿瘤防治的第四程式受到医学界广泛的重视。BRM的作用机制,主要是通过激活机体抗肿瘤的免疫,增强或恢复宿主对肿瘤的免疫反应。在机体肿瘤免疫监护功能及肿瘤特异性免疫应答产生的过程中,树突状细胞（dendriticcells,DCs）是功能强大的抗原提呈细胞,在肿瘤免疫抑制中起重要作用,具有激活静息型T细胞及诱导初级免疫应答的能力。然而肿瘤细胞能够逃避宿主的免疫监视系统,使肿瘤得以生长及转移;肿瘤对DC还有抑制作用,可造成免疫耐受,使T细胞的特异性杀伤性失去靶向。因此,DC特有的生物学特性使其成为了当今肿瘤生物治疗领域备受关注的焦点之一。由于DCs的重要功能使人们越来越多地关注DCs的临床应用,特别是其抗肿瘤作用,目前应用DC治疗肿瘤已取得了初步成果,一系列动物实验研究证明DC可以诱导特异性抗肿瘤保护效应,使肿瘤消退或稳定。但是仍有许多问题有待进一步研究解决,怎样恢复肿瘤内环境受抑的DC,如何提高DC介导的T细胞的杀伤活性?因此,寻找简单、经济、有效的刺激物作为免疫佐剂,更有效地激发机体抗肿瘤的免疫反应,是今后肺癌防治的一个方向。茶氨酸是绿茶的提取物,可通过多种机制防治肿瘤,在生物化学及分子水平对肿瘤发生的多个环节进行干预,调节免疫器官功能,防止免疫抑制,延缓荷瘤动物免疫衰退,增强肿瘤特异性和非特异性免疫,对机体抗癌“主力军”细胞毒T细胞杀伤肿瘤细胞功能有明显增强作用。而茶氨酸作为生物反应调节剂,未发现任何毒性反应。预实验采用模拟肿瘤细胞分泌细胞因子抑制DC环境,用蛙皮素与DC细胞共培养（蛙皮素是肿瘤细胞分泌主要抑制DC的细胞因子之一）,证实蛙皮素与DC前体细胞共培养时可显著减少DC的数量,DC表达HLA-DR、CD86、CD83、CD80、CD40显著减低,DC刺激淋巴细胞反应的能力下降,而茶氨酸刺激蛙皮素抑制DC,HLA-DR、CD80、CD86、CD83、CD40表面分子表达明显增强,接近正常对照组。因此,推测茶氨酸可拮抗肿瘤内环境肺癌细胞分泌蛙皮素对DC的抑制,提高DC刺激T淋巴细胞增殖的能力,增强对肺癌细胞的杀伤力。故行模拟肺癌内环境下蛙皮素抑制DC,以及SCID小鼠（A549）移植瘤实验,采用茶氨酸作为受试因素,观察对蛙皮素抑制DC以及对SCID小鼠移植瘤的影响。方法:健康人外周血来源单个核细胞,严格按照DC的分离培养、扩增方法,行形态学,DC特征性表面分子检查,进行DC鉴定。与蛙皮素共培养,行DC电镜、特征性表面分子检查、凋亡检测,建立蛙皮素抑制DC的模型。茶氨酸拮抗蛙皮素对DC的抑制实验:模拟肺癌内环境肺癌细胞分泌蛙皮素对DC抑制作用,建立蛙皮素抑制DC模型,用茶氨酸进行干预,通过对DC形态学,功能成熟的影响及COX-2表达等证明茶氨酸对肿瘤环境下肿瘤细胞分泌蛙皮素抑制DC的保护和活化效应。分茶氨酸+蛙皮素DC组;蛙皮素DC组;PBSDC组。通过蛙皮素抑制DC,用茶氨酸干预后与正常组DC对比,观察不同茶氨酸浓度对蛙皮素抑制DC表面分子（CD40、CD80 CD83、CD86、HLA-DR）和白介素-12（IL-12）的影响（剂量-效应关系）,对抑制DC凋亡的分析,DC的形态学检查,以及对COX-2表达的影响（剂量.效应关系）。体内实验:通过SCID小鼠体内注射人外周血淋巴细胞,重建免疫后,以茶氨酸受试因素刺激DC细胞,用A549细胞株接种于SCID小鼠皮下,通过对SCID小鼠移植瘤模型作用观察,证实茶氨酸对DC免疫保护和免疫治疗作用。培养A549细胞,按原方法分离培养、培养DC。分茶氨酸刺激DC组、DC组、茶氨酸组、PBS组,DC以同质培养液调细胞浓度为6.25×10⁵/ml,加入24孔培养板中,每孔2ml,37℃、5%CO₂中培养7d备用,而茶氨酸组取上述培养2d的DC悬液,添加抽滤的茶氨酸,使其终浓度为200μmol/L（第一章最佳刺激浓度）,按上述培养方法培养。DC、A549、PBS、茶氨酸分别腹腔注射,行SCID小鼠致瘤性实验,观察各自致瘤性,在光镜下行组织病理学检查。SCID小鼠免疫重建实验,ELISA法检测SCID小鼠IgG水平。诱导抗肿瘤的免疫保护作用实验,观察肿瘤生长的潜伏期、肿瘤的大小、重量、存活率、生存时间,组织病理学检查。抗肿瘤治疗作用实验,观察肿瘤的大小、重量,并行组织病理学,免疫组织化学检查,观察各组瘤体组织中VEGF的表达情况。结果:显微镜下观察、电镜检测,呈典型的DC形态学特点;CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达增强,CD83是DC特征性表面分子,从形态学和特征性的表面分子鉴定是DC。纯度、活细胞数检查,符合DC的后续实验要求。加入蛙皮素后共培养,电镜检查,包膜突起少,凋亡实验,其凋亡率是16%,特征性表面分子表达降低,与肺癌细胞和DC共培养的一致,故蛙皮素抑制DC的模型成功建立。模拟肺癌细胞分泌蛙皮素抑制DC,加入茶氨酸培养,7天后流式细胞仪检测DC表面分子的表达情况,茶氨酸能够上调CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达,用不同浓度的茶氨酸（25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L）处理DC,结果其效应呈浓度依赖性,并且最佳浓度为200μmol/l,因为浓度大于200μmol/l时（如400μmol/l）表面分子的表达降低。在DC培养的第7天,观察茶氨酸对DC凋亡的影响,与蛙皮素组相比,茶氨酸处理组能够抑制蛙皮素促使DC凋亡的作用。其凋亡率分别是:蛙皮素组16.0%;茶氨酸处理DC组8.4%;PBS组4.0%。茶氨酸能够促进DC分泌IL-12,ELISA结果显示DC在未做任何处理时（即蛙皮素组）IL-12分泌的量很少（63.5±3.6pg/ml）,茶氨酸和正常组的DC能够分泌高水平的IL-12,200μmol/l浓度时为:90.4±4.9pg/ml,此试验结果与对表面分子表达的影响、抗凋亡实验的结果综合起来说明茶氨酸能够拮抗蛙皮素对DC的抑制作用,促进DC功能的成熟,并且呈浓度依赖性。茶氨酸处理组的DC扫描电镜照片展示出比较成熟的形态学特征,DC培养至第7天时收集,茶氨酸处理组和正常组的DC表面可见很长的突起,这是DC成熟的特征;而未做处理的DC（即蛙皮素组）的突起很短甚至没有突起。茶氨酸对树突状细胞COX-2 mRNA表达的影响,不同浓度茶氨酸处理DC 7天,RT-PCR检测COX-2 mRNA的表达,随着药物浓度的增加,表达降低,呈浓度依赖性。对树突状细胞COX-2蛋白表达,不同浓度茶氨酸处理DC 7天Western-blot检测COX-2蛋白表达。结果显示,茶氨酸作用后,可见COX-2蛋白表达的抑制,随着药物浓度增加,抑制效应增强。第一部分得出最佳刺激浓度为200μmol/L,使用该浓度刺激DC,行肺癌A549细胞株SCID小鼠移植瘤实验,腹腔注射人外周血淋巴细胞免疫重建,行SCID小鼠致瘤性实验,A549组SCID小鼠肺组织表面转移瘤结节数量较多,结节较大,部分结节相互融合,结节中央可见坏死。在光镜下行组织病理学检查,均可见肿瘤组织呈实体样结构或腺腔样结构,肿瘤细胞长梭形,核大,核仁明显,可见核分裂象,胞浆微呈透明稍嗜碱,细胞大小不等,癌细胞被纤维组织分隔成大小不等的癌巢,肺转移瘤模型成功建立。DC组未见肿瘤的生成。因此,A549具致瘤性,符合腺癌的特征。诱导抗肿瘤的免疫保护作用实验,茶氨酸刺激DC组肿瘤生长的潜伏期延长、生存时间较对照组延长,肿瘤的体积较对照组小,重量较对照组轻,组织病理学检查可见不同程度的坏死。抗肿瘤治疗作用实验,肿瘤体积和重量两两比较有差异性,并行组织病理学检查可见不同程度的坏死。免疫组织化学检测,观察各组瘤体组织中VEGF的表达情况比较。结果显示茶氨酸刺激DC能明显抑制SCID小鼠移植瘤细胞表达VEGF。免疫组织化学检测VEGF在肿瘤中的表达,分析显示棕黄色颗粒主要定位于胞浆,VEGF在PBS、茶氨酸组肿瘤组织中呈高表达,而在茶氨酸刺激组和/或DC组肿瘤组织中表达减弱,VEGF的表达总记分情况:茶氨酸刺激DC组＜C组＜茶氨酸组＜PBS组,两两比较,茶氨酸、PBS组没差别,余有明显差别。结论:1.本实验成功分离、扩增、分化树突状细胞。以健康人外周血单核细胞为树突状细胞前体细胞诱导成熟树突状细胞,是体外大量生成树突状细胞的一条重要途径。GM-CSF是生成和维持树突状细胞发育和分化的最根本的细胞因子一,IL-4抑制粒细胞和巨噬细胞产生,促进单核细胞向树突状细胞的转化,并维持树突状细胞成熟。2.成功建立模拟肿瘤内环境蛙皮素抑制树突状细胞的模型。3.茶氨酸可能是通过抑制COX-2的表达,减少内源性的IL-10合成,促使树突状细胞的成熟,从而促使IL-12的分泌,调节IL-10/IL-12的平衡机制来实现。4.SCID小鼠实验中的细胞和体液免疫缺陷,行腹腔注射T细胞,成功实现免疫重建。腹腔注射A549细胞,成功建立肺腺癌模型。5.茶氨酸刺激树突状细胞介导T细胞抑制SCID小鼠肺腺癌移植瘤作用,提示茶氨酸刺激树突状细胞调节T细胞,可能是通过免疫监视及清除畸变细胞作用,以及介导VEGF的表达等机制来实现。