铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是兰科石斛属多年生草本单子叶植物,具有极高的药用价值和观赏价值。铁皮石斛具有兰科植物共有的原球茎发育模式,即种子发育成熟时其种胚仍停留在未分化阶段,需经历原球茎时期才能发育成完整植株。由于需求的自然环境要求高和人为的大肆采摘,现已沦为濒危物种。本研究共分为四个方面,铁皮石斛原球茎不同时期的形态观察研究,铁皮石斛中泛素活化酶E1(DoUBA)家族鉴定与分析、铁皮石斛中泛素结合酶E2(DoUBC)家族鉴定与分析以及DoUBC9的克隆鉴定与表达分析。主要实验结果如下:(1)原球茎发育一般经历七个时期P1~P7,分别为:种胚活化突破种皮,原球茎形成,原分生组织形成,顶端分生组织形成,椭球形原球茎形成,叶原基维管形成和根端分生组织形成。对各个时期的原球茎进行挑选,使用体视镜和扫描电镜进行形态观察记录。(2)泛素活化酶E1是泛素-蛋白酶体途径中涉及的第一个酶,负责靶蛋白的活化,在泛素化途径中起着关键性作用。本研究利用三代转录组测序,从利用GO分析、KEGG分析等方法注释的序列文件以及使用SMART、CDD结构域查询去冗余后,共获得4个DoUBA家族成员。对其预测蛋白分析,均为脂溶性疏水蛋白,除DoUBA2外均为酸性蛋白,除DoUBA3外均为稳定蛋白,亚细胞定位其大概率分布在溶酶体、细胞核以及叶绿体内,均无跨膜域,二级结构以α-螺旋和无规卷曲占比最多。使用FPKM的方法对各基因进行定量分析,DoUBA1、DoUBA2、DoUBA3三个基因在各个时期广泛高表达,而DoUBA4在P2和P4时期极度低表达。(3)泛素结合酶E2是泛素-蛋白酶体途径中涉及的第二个酶,负责活化后靶蛋白的传递,属于中间酶,家族基因数量繁多。本研究通过构建铁皮石斛基因组本地数据库,使用Blast、本地比对以及HMMER三种方法,结合SMART、CDD结构域验证的方式,共搜索确认62个铁皮石斛泛素结合酶E2家族成员。基因结构分析中,62个家族成员包含0~15个内含子;蛋白基序分析中,大多数都包含motif1、motifi2和motifi3中的一个或者两个基序;系统进化分析中,62个DoUBC基因与拟南芥、玉米和水稻的UBC被分成15个亚家族,每个亚家族的DoUBC基因拥有较为一致的motifi基序;蛋白序列完全比对中,不仅发现UBC家族共有的“HPN”和“PxxPP”保守的蛋白序列,还发现了铁皮石斛特有的“D/NP”保守序列;蛋白生化特征分析中,62个蛋白均为非脂溶性亲水蛋白,且全是酸性蛋白,大多数稳定;使用qRT-PCR技术对DoUBC家族进行表达量分析,有6个基因在P1~P7原球茎时期不表达或者极低表达外,其余56个基因在原球茎各时期广泛表达,有23个基因表达量先下降后上升,有22个基因的表达量先上升后下降,其中绝大部分基因在P5时表达量最低,此外,大部分基因在P3和P7时期表达量最大。(4)为了研究泛素结合酶UBC9在铁皮石斛原球茎发育过程中的分子机制,本研究利用生物信息学手段,从已获得的铁皮石斛基因组中鉴定出UBC9基因,命名为DoUBC9,并利用RACE技术,克隆出DoUBC9 3’端,通过与基因组序列拼接,获得完整序列。DoUBC9的CDS长度为447bp,共编码148个氨基酸,具有3个外显子,外显子加内含子共7,176bp;DoUBC9编码蛋白为酸性、不稳定性蛋白,分子量为16,436.97Da,等电点pI 7.76,体外半衰期30h;其二级结构中,α螺旋、延伸链、无规卷曲、β折叠各占34.46%、18.92%、39.19%、7.43%;亚细胞定位预测结果表明,DoUBC9蛋白大概率分布于分泌囊泡和质膜上。序列比对和进化树分析表明,铁皮石斛DoUBC9和其他物种中的UBC9拥有高度保守的UBCc结构域,进化关系高度保守。qRT-PCR分析表明,在不同组织部位中,DoUBC9在愈伤组织中的表达量最高、叶中表达量最小;在原球茎发育过程中,在P1时期具有最高表达量,其他各时期表达量较小,表明该基因可能促进了植物体的细胞快速分裂与生长。