研究背景和目的:外周动脉病(Peripheral artery disease,PAD)是全球范围内的公共健康问题,在过去的十年间PAD患者数量持续上升,并且成为非创伤性截肢的主要原因。糖尿病作为独立危险因素不仅增加了PAD的患病风险,而且容易发展为严重的肢体缺血(Critical limb ischemia,CLI)。研究发现糖尿病高血糖引起的内皮细胞损伤与PAD的病情进展有关,因此,针对内皮细胞的有益干预可能成为治疗糖尿病PAD的一种方法。自噬是细胞内降解物质,实现物质循环,维持细胞内环境稳态的重要机制。研究发现糖尿病状态下内皮细胞自噬功能异常可能是引起糖尿病血管并发症的原因。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1(mTORC1)是一种调节自噬的关键分子,本课题通过转基因技术特异性敲除小鼠血管内皮细胞mTORC1,以研究其对糖尿病下肢缺血小鼠的影响,并在离体水平研究调节mTORC1对高糖缺氧诱导内皮细胞损伤的影响和机制。研究方法:Cre/lox P重组酶体系构建内皮特异性Raptor(mTORC1)敲除小鼠。通过腹腔注射链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)诱导小鼠糖尿病模型,并在此基础上建立下肢缺血模型。建模成功后,通过激光多普勒血流灌注成像(Laser Doppler Perfusion Image,LDPI)系统分别于术后0、3、7、14天检测下肢血流灌注,通过运动功能评分和缺血评分分别评价运动功能和下肢缺血情况,并且于术后14天通过免疫荧光、免疫组织化学法检测血管新生标志物,术后7天通过TUNEL和DHE荧光探针检测腓肠肌凋亡和氧化应激情况。体外实验通过培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)并进行高糖缺氧处理以模拟糖尿病下肢缺血条件下的内皮细胞。通过转染小干扰RNA(siRNA)调节mTORC1,采用流式细胞术检测细胞凋亡,小管形成实验评价内皮细胞功能,ROS荧光探针检测氧化应激,JC-1荧光探针检测线粒体膜电位,并通过Western blot检测自噬相关蛋白LC-3和STSQM1以及mTORC1信号通路相关蛋白Raptor、mTOR、p-mTOR、P70S6K、p-P70S6K、p-ULK1,ULK1的表达。研究结果:术后7天和14天LDPI结果显示,内皮特异性Raptor敲除促进了糖尿病小鼠下肢缺血后血流恢复,并且改善了缺血症状和运动功能。新生血管标志物CD31和α-SMA结果显示,内皮特异性Raptor敲除促进了小鼠下肢血管新生,这一结果可能与mTORC1调节的自噬有关。此外,内皮特异性Raptor敲除减轻了糖尿病PAD小鼠下肢氧化应激,并减少了腓肠肌的凋亡。高糖缺氧条件下内皮细胞存活显著降低,细胞凋亡增加,管样形成能力下降,下调mTORC1或使用自噬诱导剂雷帕霉素可以促进细胞存活,减少细胞凋亡,提高管样形成能力;相反,上调mTORC1或使用自噬抑制剂3-MA则进一步加重了高糖缺氧对内皮细胞造成的损伤。通过Western blot检测LC-3和STSQM1的表达,结果发现高糖培养降低了内皮细胞的自噬水平,并损伤了缺氧诱导自噬的能力,下调mTORC1可以恢复自噬流。检测mTORC1信号通路分子表达发现,高糖条件过度激活了mTORC1及下游P70S6K并且抑制了ULK1的表达。此外,高糖缺氧条件下内皮细胞氧化应激水平增加,线粒体膜电位降低,通过下调mTORC1可以促进自噬,清除损伤的线粒体,恢复线粒体膜电位,减轻氧化应激,进而起到保护内皮细胞的作用。研究结论:本实验率先采用内皮特异性mTORC1敲除小鼠研究内皮细胞mTORC1在糖尿病下肢缺血模型中的作用和机制。研究揭示:内皮特异性敲除mTORC1可以改善糖尿病PAD小鼠下肢缺血症状,提高运动功能,促进血管新生,减轻氧化应激,减少凋亡。这些有益的作用可能与下调mTORC1促进自噬,清除损伤的线粒体减少氧化应激有关。我们的研究结果为临床应用mTORC1抑制剂治疗糖尿病血管并发症提供了一些有利的参考,并为可能的下一步临床前瞻性研究提供了一些的借鉴。