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背景:2型糖尿病已经成为全球性危害人类健康的重要问题,其特征主要是胰岛素抵抗和胰岛素分泌相对不足。改善胰岛素抵抗是延缓2型糖尿病进程的重要手段。葛根芩连汤是传统经方,前期研究证实该方可以改善初诊2型糖尿病患者的胰岛素敏感性,但其作用机制尚不明了。目的:应用网络药理学方法联合质谱分析技术探讨葛根芩连汤的化学组分及该方潜在的作用机制。本研究着眼于葛根芩连汤对肝脏胰岛素抵抗的调节作用,从体内体外研究葛根芩连汤通过miR-146b/SIRT1改善肝脏胰岛素抵抗的作用,力求阐明葛根芩连汤从“肝”治疗糖尿病。方法:(1)应用网络药理学方法,结合生物信息数据库分析葛根芩连汤中草本来源药物的化学组成及其潜在治疗靶点与涉及的信号通路,从多角度综合地分析葛根芩连汤的作用机制。(2)以高脂诱导的C57BL/6J胰岛素抵抗小鼠为模型,用不同剂量的葛根芩连汤干预,腹腔葡萄糖耐量实验(IPGTT)及腹腔胰岛素耐量实验(IPITT)评估胰岛素抵抗状态,Elisa法检测小鼠血清中生化、胰岛素水平,肝脏HE染色,蛋白印迹法结合qPCR检测肝脏组织SIRT1/FoxO1信号通路中相关的蛋白及mRNA的表达。(3)以棕榈酸诱导HepG2细胞建立胰岛素抵抗HepG2细胞模型,用葛根芩连汤含药血清干预,测定糖原含量,蛋白印迹法结合qPCR检测SIRT1/FoxO1信号通路中相关的蛋白及mRNA的表达。(4)检测葛根芩连汤干预后高脂诱导的C57BL/6J胰岛素抵抗小鼠的miR-146b的表达。分别用miR-146b mimics和miR-146b inhibitor转染HepG2细胞,蛋白印迹法结合qPCR检测SIRT1/FoxO1信号通路中相关的mRNA、蛋白表达。结果:(1)网络药理学分析共检索得到与葛根芩连汤相关的化合物389种,涉及191条信号通路。在P值前10名的通路中,和本研究相关的通路包括糖尿病并发症相关的糖基化终末产物及其受体信号通路及内分泌抵抗信号通路。(2)UPLC/LTQ-Orbitrap测定葛根芩连汤水提剂和含药血清中含有最多的单体成分均包含:葛根素、汉黄芩素、黄芩苷、药根碱、大豆苷元、巴马汀、小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素和甘草酸。(3)葛根芩连汤能明显减轻高脂诱导下小鼠的体重,降低ALT、AST、TC、TG、INS及HOMA-IR,改善葡萄糖耐量和胰岛素耐量。肝脏HE染色显示,葛根芩连汤能减轻肝脏空泡变性,减少脂滴沉积。肝脏组织中葛根芩连汤各剂量组SIRT1 mRNA表达明显高于高脂对照组。Western blot结果显示,高脂组小鼠肝脏中SIRT1、PPARγ蛋白表达水平比正常组明显下降,Ac-FoxO1、FABP4蛋白表达水平升高,药物干预后,各组肝脏组织SIRT1、PPARy蛋白表达水平明显升高,Ac-Fox01、FABP4表达降低。(4)棕榈酸诱导后HepG2细胞糖原含量明显下降,细胞中SIRT1和PPARγ的表达明显降低,同时FABP4和乙酰化FoxO1表达增加;葛根芩连汤含药血清能逆转棕榈酸诱导后HepG2细胞糖原合成能力下降过程,上调棕榈酸诱导后HepG2细胞的SIRT1和PPARγ的表达,并抑制FoxO1乙酰化。siRNA干扰的SIRT1表达后,同阴性对照组相比,葛根芩连汤组乙酰化FoxO1的水平没有明显变化。(5)和正常饮食组相比,高脂模型组小鼠肝脏miR-146b的表达明显增加;而加用葛根芩连汤干预治疗后,miR-146b的表达明显降低。与对照组相比,棕榈酸诱导后miR-146b表达明显增加,加用葛根芩连汤能够明显抑制miR-146b的表达。Weston blot显示,过表达的miR-146b能抑制SIRT1蛋白的表达,沉默miR-146b能够增强SIRT1的表达。结论:(1)网络药理学分析发现葛根芩连汤主要参与的信号通路在KEGG中包括糖尿病并发症相关的糖基化终末产物及其受体信号通路及内分泌抵抗信号通路图。(2)实验证明葛根芩连汤可以通过抑制miR-146b,上调SIRT1水平,降低FoxO1的乙酰化,改善肝脏胰岛素抵抗。