论文部分内容阅读
位于小鼠1号染色体结核超敏感位点的胞内病原体抗性基因1(Ipr1基因)在机体对抗胞内病原体(如结核杆菌)感染的过程中起重要作用。其同源基因位于牛2号染色体以及人2号染色体的SP110(Ipr1)基因,能够抑制结核杆菌在宿主细胞中的增殖。研究发现,SP110的单核苷酸多态性和宿主是否易感结核密切相关。在胞内病原体感染时,Ipr1/SP110被激活并参与细胞免疫的过程中,与Ipr1类似,免疫相关的GTP酶家族M蛋白1(Irgm1)在病原体入侵引起的自噬调控中具有十分重要的作用。Ipr1与Irgm1都属于结核抗性基因,迄今为止,Ipr1以及Irgm1在宿主细胞中的调控方式尚不清楚。因此研究Ipr1以及Irgm1在细胞内的表达调控对理解机体对抗胞内病原体的机理具有重要作用。本研究结合生物信息学分析、分子生物学、生物化学及细胞生物学研究方法与技术,深入探究了Ipr1基因的上游调控机制及其通过p53调控下游靶基因Irgm1的机制。主要研究结果如下:1.通过对NCBI数据库中DNA病毒,RNA病毒以及多种结核杆菌菌株处理的免疫相关细胞(THP-1,RAW264.7等)的转录组数据进行分析,发现诺如病毒,乙型肝炎病毒,仙台病毒,甲型流感病毒,结核杆菌北京株,标准株(H37Rv)能够激活Ipr1或SP110的表达。除此之外,依托泊苷和阿糖胞苷分别在U937,A673细胞中激活SP110的表达。同时,有研究证明,DNA病毒,H37Rv,依托泊苷以及阿糖胞苷都能够激活细胞内c GAS-IRF3通路。2.c GAS-IRF3通路参与调控Ipr1的表达。通过比对多个物种Ipr1启动子上顺式作用元件,发现ISRE位点在Ipr1的转录调控中起到了关键作用。c GAS-IRF3通路激活剂ISD能够激活Ipr1的表达。而Ipr1核心启动子区上的ISRE突变后,Ipr1核心启动子失去对ISD的应答。过表达IRF3能够显著的激活Ipr1的转录。凝胶阻滞实验和染色质免疫共沉淀实验证明了IRF3可以结合到Ipr1的启动子区上,进而发挥调控Ipr1基因表达的功能。3.Ipr1参与ISD诱导的Irgm1表达调控。Irgm1是调控细胞自噬的关键基因。当使用ISD处理RAW264.7细胞时,Irgm1的m RNA和蛋白质水平显著提高。Irgm1基因的转录起始位点上游470bp到下游462bp是其核心启动子区。ISD处理能够显著激活该段启动子的转录活性。当干扰Ipr1后,Irgm1的表达受到了显著的抑制。过表达Ipr1能够提高Irgm1的启动子活性。4.p53参与Irgm1的表达调控。通过Irgm1的启动子区域顺式作用元件预测发现,在Irgm1的启动子上含有p53的识别位点。该位点的突变显著下调Irgm1的启动子活性。当使用Act D,ISD处理细胞或在细胞中过表达p53后,p53位点突变的启动子活性显著低于野生型。使用Act D,ISD处理细胞或在细胞中过表达p53都能够激活Irgm1基因的转录。5.Ipr1通过与Rpl11,Mdm2的互作调控p53的稳定性。在静息状态下,p53与Mdm2结合并通过泛素化而降解。对Ipr1,Mdm2以及p53互作蛋白的聚类分析发现,Rpl11与Ipr1,Mdm2以及p53都存在相互作用。Co-IP证明Ipr1与Rpl11,Mdm2存在蛋白水平上的相互作用。未过表达Rpl11的情况下,Ipr1对Mdm2与p53的相互作用无显著影响。当体系中加入Rpl11后,过表达Ipr1加强了Rpl11与Mdm2的互作,同时Mdm2与p53的互作受到了显著的抑制。过表达Ipr1可以显著减少泛素化p53的含量。这些结果说明Ipr1通过Rpl11调控Mdm2和p53的互作。本研究阐明了胞内病原体抗性基因Ipr1的上游调控机制以及Ipr1通过p53蛋白调节下游靶基因Irgm1的机制。已有报道证明胞内病原体如结核杆菌的入侵能够激活p53通路,但其详细机理仍然没有被解释清楚。c GAS-IRF3通路作为近几年发现的与细胞免疫直接相关的通路,与p53通路也存在密切联系。通过对Ipr1基因上下游调控机制的研究,本研究证明c GAS-IRF3通路调控Ipr1的表达;Ipr1蛋白能够增强Rpl11和Mdm2蛋白的相互结合,从而促进Mdm2-p53蛋白复合体的分离,降低泛素化p53蛋白水平;p53参与自噬相关基因Irgm1的表达调控。本研究通过对Ipr1功能的研究,将参与细胞免疫反应的c GAS-IRF3通路与调控细胞自噬基因Irgm1表达的p53通路联系在一起,丰富了细胞内信号通路交互联系的理论研究。