研究背景心房颤动(简称房颤,AF)是临床上最常见的以房性持续紊乱为特点的快速心律失常,在AF的发生和维持中,心脏内在自主神经系统起着重要作用。心脏自主神经系统由内在及外在自主神经系统构成,心脏表面、大血管附近的神经丛(ganglionatedplexi,GP)及连接GP的神经纤维构成心脏内在自主神经系统;脑、脊髓及心脏神经丛之前的纤维构成心脏外在自主神经系统。GP是交感和迷走末梢分布在心脏表明的"集散地"或"整合中心",包含大量的迷走、交感和中间神经元,因其被心脏表明的脂肪组织所包绕又被称为"脂肪垫"。分布在心脏表面的GP 主要有四个,均位于肺静脉的根部,分别称为右上GP、右下GP、左上GP、左下GP,GP调节和支配心肌神经传导物质的释放,交感和副交感神经活性改变及过度增生,引起心房电生理的一系列改变导致AF的发生。目前AF射频消融方式主要包括:环肺静脉消融、肺静脉隔离、心房复杂碎裂电位隔离、心房神经丛消融。然而,无论何种术式,AF射频消融的远期成功率依然不尽人意,单次射频消融术后房颤远期复发率高达11%-50%,约20%-40%的患者需要二次甚至三次射频消融治疗,重复多次消融房颤远期复发率仍为7%-24%,随着手术后时间的延长,复发率呈上升趋势,消融远期效果的不尽人意与消融后AF复发机制不明有关。关于AF消融术后复发有多种解释,其中包括肺静脉-左心房连接部电传导的恢复、非肺静脉起源的房颤触发灶、与消融相关的大折返环形成以及全身和局部的炎症反应、同时也可能与射频消融造成心房基质的改变,随之发生负性电重构与结构重构有关。心脏功能的维持包括结构、电生理及神经系统的正常支配。心脏内在自主神经系统是由位于心脏表面、大血管(如肺静脉)附近的神经丛及连接神经丛的神经纤维构成。而射频消融心房神经丛时经意或不经意的会破坏心脏的电生理及结构功能,引起心房基质的改变进一步造成心脏电与结构的重构,从而介导房颤的复发。而心房基质的改变主要是射频消融造成的周围组织水肿、破坏而引起的心房纤维化,进一步导致的以心房内径及收缩舒张功能改变为主要变化的心房结构重构,已经成为AF复发的主要因素。除此之外,无论何种消融术式,都经意或不经意间的改变了心房内在自主神经的分布,引起交感和迷走神经纤维活性改变及神经再生,参与了消融后远期AF的复发,也成为AF复发的重要机制之一。本研究采用解剖定位及高频电刺激的方法确定心房右上GP及右下GP,于直视下行心外膜GP消融,观察消融即刻、术后1月、6月、12月右心房电生理的变化,以及右上GP、右下GP所支配的靶心房组织结构改变、心房功能及心脏自主神经的变化。研究目的1.观察对照组、消融后1月、6月、12月心房大小、收缩舒张功能的改变及消融前、消融后即刻、消融1月、6月、12月电生理的变化。2.消融对照组、术后1月、6月、12月靶心房组织的神经分布、密度及心房组织超微结构的改变。3.探究心房结构、组织改变以及神经重构在射频消融术后影响AF诱发性的作用及可能机制。研究方法1.实验分组及模型建立:(1)分组:32条成年杂种犬,雌雄不限,平均分为4组(n=8)。1组(对照组)右侧第四肋间开胸,制作心包吊篮,暴露心脏不做其他处理。2组-4组为实验组,右侧第四肋间开胸,制作心包吊篮,暴露右上及右下脂肪垫,并行直视下脂肪垫射频消融。2组术后观察1月处死,3组术后观察6月处死,4组术后观察12月。(2)射频消融犬模型建立:戊巴比妥钠麻醉,气管插管并连接呼吸机,给予持续心电监测。于右侧第四肋间开胸,制作心包吊篮,暴露右上及右下脂肪垫。右上脂肪垫的解剖位置为上腔静脉与右心房的交界处窦房结尾端,右下脂肪垫位于下腔静脉与左、右心房的交界处。应用电生理刺激仪对右上及右下脂肪垫行高频电刺激(20Hz,0.1ms,2-5V),出现迷走反应即心率明显减慢或出现房室传导明显延长即为脂肪垫所在部位。定位后,在直视下对右上及右下脂肪垫行射频消融,每次消融能量为20W-30W,消融时间30s-60s。消融过程中给予少量生理盐水以降低阻抗及对组织的损伤。消融的终点为脂肪垫炭化且体积变小,高频电刺激脂肪垫区域迷走反射消失。2.超声心动图检查所有动物在消融前静息状态、消融后1月、6月及12月进行超声心动图检查。犬静脉麻醉后,仰卧并固定于手术台上,左胸部及颈部备皮,连接Ⅱ导联心电图。用二维超声及超声技术于胸骨长轴测量左心房直径(LAD),在胸骨旁心尖四腔心切面测量右心房直径(RAD1,RAD2)。测量左右心房容量:(1)快速排空末期左右房容积(MDV)(2)心室舒张末期左右心房的容积(EDV)。测量心房射血分数 AEF:EF=(MDV-EDV)/MDV。以上所有参数均在窦性心率下测量,均测量三次并取其平均值。3.电生理的检测分别于右房游离壁、高位右房、右心耳放置三根电极,检测实验组(2-4组)所有动物术前、消融即刻的电生理,并分别检测实验组消融后1月、6月、12月的有效不应期。有效不应期定义为:WS1 300ms,S2 200ms,5ms步长递减刺激,有效不应期(AERP)的定义为第一个不能夺获心房的S2。房颤由高频刺激诱发,成功的房颤诱导定义为持续快速不规则的心房率超过30秒。4.标本获取最后一次电生理检测之后,对动物施以安乐死,获取犬距离右上脂肪垫1cm左右的心房组织。5.免疫组化的检测应用免疫组化方法检测靶组织心房组织中神经的分布,指标包括酪氨酸羟化酶(交感TH)和乙酰胆碱转移酶(副交感神经CHAT)。计算对照组与实验组的神经密度,来反映神经重构的情况。6.免疫印迹分析(Western blot)提取组织蛋白,利用western blot检测蛋白中CHAT、TH、神经生长因子(GAP43)的表达,GAPDH作为内参。7.电镜检查取右心房靶组织区域1mm3左右大小的组织,固定于2.5%的戊二醛中,4℃2h,磷酸缓冲液洗3次×15min,置于1%俄酸固定,4℃2h,再用0.1M的磷酸缓冲液洗3次,随后梯度酒精脱水,环氧树脂包埋。切片,电镜下观察心房肌组织的超微结构。7.统计学分析所有计量数据均用中位数和四分位数来表示,包括:超声指标、电生理、神经密度、神经蛋白表达,使用SPSS17.0统计学软件进行数据分析。各部位不同时刻的有效不应期的比较采用广义估计方程法。其他数值各组间比较采用方差分析,组内比较采用配对t检验。P<0.05被认为有统计学意义(双侧)。研究结果最终29只犬完成全部研究,1组(对照)7只,2组(实验1月)8只,3组(实验6月)8只,4组(实验12月)6只。1.超声心动图结果左心房各指标各个时期均无统计学差异。射频消融后,与对照组相比RAD、RAD2、RA-MDV和RAEF在一个月时减小(P<0.05),但在6月及12月时恢复到消融前水平,无统计学差异。RA-EDV与消融前相比,在消融后各时刻点均无统计学差异。2.心房有效不应期的变化消融后即刻与消融前相比,心房各部位AERP明显延长(P<0.001),且这种变化一直维持到消融后1月。消融术后6月-12月AERP恢复至消融前水平(P>0.05)。3.AF诱发率术前及术后对照组均未诱发出AF。2组消融后1月有5只诱发出AF,3组及4组在消融后6月及12月全部诱发出AF。4.神经密度与对照组相比,消融术后1月右心房靶组织的TH及CHAT的密度明显降低(P<0.01),然而,这种变化在6月及12月时消失,消融后6-12月,TH及CHAT密度恢复到消融前水平。5.神经相关蛋白表达量消融组神经生长因子GAP43比对照组显著增加,且随时间延长呈现出逐渐递增的趋势。消融后1月,TH及CHAT的蛋白表达比对照组相比明显降低,但6-12月逐渐恢复至对照组水平。6.电镜结果电镜下,对照组的心肌组织超微结构为高度有序排列的肌小节,闰盘清晰可见,胞膜完整。消融后1月组,与对照组相比肌组织的超微结构异型性明显。消融后6月及12月组,电镜下的超微结构与对照组相比不规则,但损伤程度较1月组轻。然而,间质纤维化随着消融后时间的延长程度逐渐加。结论1.心房神经丛消融远期引起靶心房结构、电生理及神经重构的改变,且房颤诱发性增加。2.心脏内在自主神经重构是神经丛消融犬远期房颤诱发性增加的重要机制。研究背景射频消融术后心房自主神经重构是如何发生的,目前尚不清楚。不完全的心房去神经化、不同消融术式对神经损伤程度的差异、消融过程中的高频刺激引起的神经再生以及消融术后血液中神经生长因子的表达增加等,但并不能很好解释射频消融术后房颤复发的神经重构机制。近年来,分子生物学技术的迅速发展已渗透到各个学科,生物芯片及高通量测序技术的出现为现代医学及转化医学的发展提供了强有力的手段。促进了医学从"系统、血液、组织和细胞"向"DNA、RNA、蛋白质及其相互作用层次"过渡,为从分子及基因层面揭示疾病的发病机制提供了新的手段。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的转录RNA分子,但不具备蛋白编码功能。之前,这类RNA 一直被认为是基因转录中的"噪音分子",但越来越多的研究都发现其在基因表达调控网络中发挥了重要作用。非编码RNA的数量跟生物的复杂程度有关,这也就可以解释为什么人与其他生物尽管有相似的蛋白编码基因,但生物表型却更复杂。相比于mRNAs,lncRNA的保守型差一些,但其二级结构及启动子区的保守性较好。lncRNAs已被发现可从表观遗传学、转录水平和转录后水平调控基因的表达。参与X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种生命活动。关于lncRNAs的研究,目前证实有数种lncRNA参与调节可参与神经系统、心脏发育和疾病发生过程等各种疾病的进程。如参与神经元的退化、脑发育、外周神经的损伤与修复以及神经退行性疾病。在心血管疾病中,参与心力衰竭、心肌梗死、心肌病,也可作为心脏疾病的标志物用来诊断疾病的进程。我们前期研究也发现lncRNA可参与房颤的心脏自主神经重构的发生发展过程。但lncRNA是否调控射频消融房颤复发的心房自主神经重构机制尚不明确。研究目的在神经丛消融犬急性期和远期模型上,应用高通量测序检测消融早期和远期犬右心房组织中差异表达的lncRNAs,通过生物信息学方法鉴定差异表达的lncRNA与神经丛消融后心脏自主神经重构相关。研究方法1.神经丛消融犬模型的建立分组:12条成年杂种犬,雌雄不限,平均分为4组(n=3)。1组(对照组)右侧第四肋间开胸,制作心包吊篮,暴露心脏不做其他处理,观察1月。2组(实验组)右侧第四肋间开胸,制作心包吊篮,暴露右上及右下脂肪垫,并行直视下脂肪垫射频消融,术后观察1月。3组对照组,观察6月。4组实验组,观察6月。神经丛射频消融方法见第一部分。2.神经丛消融后神经重构参照第一部分3.高通量测序并验证获取1-4组犬右心房组织,用Trizol法提取所有组织中的总RNA并测其0D值,应用二代测序系统检测lncRNA和mRNA的差异表达,用qRT-PCR的方法对随机挑选的lncRNA检测,验证测序结果的准确性。4.统计学分析全部计量数据用均数±标准差来描述,对于测序结果应用单因素方差分析比较lncRNAs的表达量及qRT-PCR结果。P<0.05被认为有统计学意义(双侧)。使用SPSS17.0统计学软件进行数据分析。研究结果1.高通量测序数据分析通过测序结果分析得到,一共检测到基因数目为32705个,新的未知基因有2590个,其中差异表达基因1组与2组比较有160个,1组与3组比较有1615个,3组与4组比较有558个。2.lncRNAs数据分析测序结果显示,共检测到lncRNAs7596个,其中新预测到的lncRNAs有3356个。差异表达的lncRNA,1组与2组比较有11个,1组与3组比较有33个,3组与4组比较有36个。3.验证结果随机挑选6个全新的lncRNA,qRT-PCR结果证实测序结果真实可靠。结论神经丛消融犬模型中,存在一系列差异表达的lncRNAs,且差异表达的lncRNAs参与神经丛消融犬房颤易诱发的心脏自主神经重构。