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谷氨酸是中枢神经系统中最重要的兴奋性氨基酸递质,因其不能在胞外代谢,胞外溶液中多余的谷氨酸只能依靠谷氨酸转运体(兴奋性氨基酸转运体,excitatory amino acid transporters,EAATs)进行回收利用,否则突触间隙内过量的谷氨酸会造成神经元的兴奋性毒性损伤。因此,谷氨酸转运体在预防神经兴奋性毒性方面极为重要。真核EAAT和原核谷氨酸转运体具有相似的蛋白结构,它们均由三个相同的楔形亚基聚合而成,但与原核相比,EAAT的4b-4c环多了 50多个氨基酸残基,提示EAAT的4b-4c环可能具有不一样的作用。虽然EAATlcryst的晶体结构已破解,但其4b-4c环的原有残基中,有26个被删除了且有18个被突变了,因而无法反映4b-4c环天然的结构信息。考虑到4b-4c环与EAATs的功能及亚细胞定位密切相关,我们推测环上可能存在某些影响蛋白活性的关键氨基酸残基;另外,由于4b-4c环在转运过程中还支持螺旋发卡环(helical hairpin,HP)1、HP2及跨膜区段(transmembrane domain,TM)7参与局部变构,我们推测4b-4c环与TM8之间也可能存在密切的相互运动关系。因此,为验证以上推测,我们进行了以下两部分研究。第一章 丙氨酸扫描突变鉴定EAAT1 4b-4c环上的关键氨基酸残基我们首先利用丙氨酸扫描突变的方法对EAAT1 4b-4c环上的所有残基进行逐一筛查,发现突变体T192A、Y194A、N242A和G245A的转运活性显著降低,还发现T192A和Y194A在膜蛋白表达水平下降了 80%左右,而在胞浆蛋白水平明显升高。另外,保守突变的突变体T192S和Y194F的转运活性和膜蛋白的表达水平都得到了明显恢复,它们的Km值也与野生型相当;相比之下,N242和G245被保守的氨基酸残基替代后,蛋白的转运活性并没有获得明显改善,说明N242和G245氨基酸残基在底物转运过程中不可替代。这部分结果证明4b-4c环上的T192、Y194、N242和G245是EAAT1转运底物所必需的氨基酸残基,而T192和Y194对EAAT1的膜蛋白表达水平还具有决定性的影响。第二章 EAAT1 4b-4c环与TM8在转运周期中的相对运动为了探讨4b-4c环在转运周期中的空间位移与蛋白功能的关系,我们在CL-EAAT1(无半胱氨酸的EAAT1)的4b4c环与TM8之间引入了成对的半胱氨酸突变。结果发现氧化剂Cu(Ⅱ)(1,10-phenanthroline)3(CuPh)可显著抑制突变体V238C/I469C和A243C/I469C的转运活性,但对相应的单点突变体和其他20多个双点突变体均无明显抑制。二硫苏糖醇对细胞的处理可部分逆转CuPh对突变体V238C/I469C和A243C/I469C的抑制效应,证明CuPh对蛋白活性的抑制确实源于突变体内二硫键的形成。另外,在培养基中添加谷氨酸、KCl和DL-TBOA均可减弱CuPh对突变体V238C/I469C活性的抑制,但只有KCl能减弱CuPh对突变体V243C/I469C活性的抑制,说明4b-4c环和TM8a在EAAT1向内开放过程中会互相远离。这部分结果证明EAAT1的4b-4c环和TM8在转运过程中会发生相互靠近,但在向内开放时相中相距较远。总之,本研究发现EAAT1的4b-4c环上有四个关键的氨基酸残基可能通过影响蛋白的表达、对底物的亲和力以及局部变构而显著影响EAAT1的摄取活性;接着,我们又证明了 4b-4c环与TM8a在转运过程中能够相互靠近,从而揭示了4b-4c环与转运核心区之间存在着涉及面更广的互动关系。