目的:1.建立人iPSCs诱导类肝细胞模型。2.初步评价人iPSCs诱导类肝细胞在中药肝毒性检测中的应用。方法:1.人iPSCs诱导类肝细胞的细胞因子4阶段诱导分化方法:第1阶段,内胚层细胞的诱导,即在人iPSCs中加入100ng/mL激活素A(ActivinA)、10ng/mL骨形态发生蛋白-4(Bone Morphogenetic Proteins-4,BMP-4)、20 ng/mL 成纤维生长因子-2(Fibroblast Growth Factor-2,FGF-2)、2%B27 和 1640 细胞培养液,每天换诱导培养液,一共8天;第2阶段,内胚层细胞向类肝细胞的分化,即加入20 ng/mL BMP-4、10 ng/mL FGF-2、2%B27和1640细胞培养液,每天换诱导培养液,一共5天;第3阶段,类肝细胞的扩增,即加入20 ng/mL肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)、2%B27和1640细胞培养液,每天换诱导培养液,一共5天;第4阶段,类肝细胞的成熟,加入HCM和20ng/mL制瘤素M(Oncostatin M),每天换诱导培养液,一共5天。用倒置荧光显微镜拍摄人iPSCs的诱导过程中细胞形态动态变化,观察人iPSCs诱导类肝细胞是否具有肝细胞的形态。2.免疫细胞化学染色(immunofluorescence staining):用4%浓度的多聚甲醛固定细胞,然后用0.5%Triton在细胞表面穿孔,用山羊血清封闭1个小时,加入1%BSA稀释的一抗,37 ℃杂交2个小时,避光放置在4 ℃过夜,加入的1%BSA稀释的二抗,放置在37 ℃,杂交1个小时。加入5μg/mL的DAPI染核,拿到荧光显微镜下拍照并保存图片。观察人iPSCs诱导类肝细胞过程中的特异性蛋白:倒置荧光显微镜观察诱导过程中的第8天后限定性内胚层特异性蛋白叉头框转录因子A2(Forkhead-box A2,FOXA2)和性别决定区 Y 框蛋白 17(Sex determining region Y-box 17,SOX17)的表达情况,看其是否表达来确定内胚层细胞是否诱导成功;第18天后肝细胞特异性蛋白甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、白蛋白(Albumin,ALB)的表达情况,看其是否表达来确定类肝细胞是否形成;第23天后成熟肝细胞功能蛋白α 1-抗胰蛋白酶(α 1-antitrypsin,AAT)、肝细胞色素 P4503A4(cytochromeP450,CYP3A4)的表达情况,看其是否表达来确定诱导后的类肝细胞是否具有人成熟肝细胞的主要功能特异性蛋白。3.实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time PCR):提取总RNA,然后按照试剂盒进行逆转录和荧光定量PCR,使用7500 PCR仪检测。检测诱导第23天后肝细胞特异性基因细胞角蛋白8(Cytokeratin8,CK8)、细胞角蛋白18(Cytokeratin18,CK18)、细胞角蛋白 19(Cytokeratin19,CK19)、AFP、ALB 的表达,观察诱导后的类肝细胞的人肝细胞是否表达人成熟肝细胞的主要基因。4.吲哚青绿(ICG)摄取实验:第23天,我们将ICG加入到类肝细胞中,37 ℃孵育1 h,光学显微镜下观察ICG是否被诱导后的类肝细胞摄取以确定诱导后的类肝细胞是否具有肝细胞的特异性功能。5.雷公藤冻干粉对人iPSCs诱导类肝细胞的肝功能的影响:诱导完成后,在成功诱导好的类肝细胞中加入雷公藤冻干粉0 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL,在37 ℃,5%CO2的细胞培养箱中培养24h,取细胞培养上清按照试剂盒操作方法,用酶标仪在570 nm检测OD值并计算谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活性,取细胞按照试剂盒操作方法,用酶标仪在532 nm检测OD值并计算丙二醛(MDA)的浓度,在410 nm检测OD值并计算谷胱甘肽(GSH)的浓度和在450 nm检测OD值并计算超氧化物歧化酶(SOD)的活性,初步评价雷公藤冻干粉对人iPSCs诱导类肝细胞的肝毒性作用。6.雷公藤冻干粉对L02细胞的肝功能的影响:诱导完成后,在L02细胞中加入雷公藤冻干粉 0 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL,在 37 ℃,5%CO2的细胞培养箱中培养24 h,取细胞培养上清按照试剂盒操作方法,用酶标仪在570 nm检测OD值并计算ALT、AST的活性,取细胞按照试剂盒操作方法,用酶标仪在532 nm检测OD值并计算MDA的浓度,在410 nm检测OD值并计算GSH的浓度和在450 nm检测OD值并计算SOD的活性,初步评价雷公藤冻干粉对L02细胞的肝毒性作用。7.雷公藤甲素对人iPSCs类肝细胞的肝功能的影响:诱导完成后,在成功诱导好的类肝细胞中加入雷公藤甲素0 mg/mL、2 mg/mL、6 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL,在37 ℃,5%CO2的细胞培养箱中培养24 h,取细胞培养上清按照试剂盒操作方法,用酶标仪在570 nm检测OD值并计算ALT、AST的活性,取细胞按照试剂盒操作方法,用酶标仪在532 nm检测OD值并计算MDA的浓度,在410 nm检测OD值并计算GSH的浓度和在450 nm检测OD值并计算SOD的活性,初步评价雷公藤甲素对人iPSCs诱导类肝细胞的肝毒性作用。8.雷公藤甲素对L02细胞的肝功能的影响:诱导完成后,在L02细胞中加入雷公藤甲素 0 mg/mL、2 mg/mL、6 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL,在 37 ℃,5%CO2 的细胞培养箱中培养24 h,取细胞培养上清按照试剂盒操作方法,用酶标仪在570 nm检测OD值并计算ALT、AST的活性,取细胞按照试剂盒操作方法,用酶标仪在532 nm检测OD值并计算MDA的浓度,在410 nm检测OD值并计算GSH的浓度和在450 nnm检测OD值并计算SOD的活性,初步评价雷公藤甲素对L02细胞的肝毒性作用。9.雷公藤冻干粉对人iPSCs诱导类肝细胞和L02细胞的肝功能的影响比较对比雷公藤冻干粉对人iPSCs诱导类肝细胞与雷公藤冻干粉对L02细胞的肝毒性作用,初步评价人iPSCs诱导的类肝细胞在中药肝毒性检测中的应用。10.雷公藤甲素对人iPSCs诱导类肝细胞和L02细胞的肝功能的影响比较对比雷公藤甲素对人iPSCs诱导类肝细胞与雷公藤甲素对L02细胞的肝毒性作用,初步评价人iPSCs诱导类肝细胞在中药肝毒性检测中的应用。结果:1.人iPSCs诱导类肝细胞分化过程中的细胞形态动态变化:倒置荧光显微镜光学图片显示,诱导的第Od的人iPSCs呈克隆团块样生长,每个克隆团块由多个单个细胞相互密集契合组成,单个细胞的大小、形状不一致,边缘棱角清晰;诱导的第3d,相对于第0d,克隆内的细胞逐渐变大,形态逐渐变圆;诱导第12 d,可观察到相对于第3d,克隆内的细胞变大,形状趋于一致,棱角逐渐不明显;诱导第23 d,克隆内的大部分细胞变成大小、形状均一的多边形细胞,细胞呈铺路石样整齐排列。说明人iPSCs诱导类肝细胞具有人肝细胞的形态。2.免疫细胞化学染色结果:免疫细胞化学染色检测结果显示限定性内胚层特异性蛋白FoxA2和Sox17在内胚层细胞诱导阶段有表达,诱导率均为80%左右,说明内胚层细胞诱导成功;肝细胞特异性蛋白AFP和ALB在人iPSCs向类肝细胞分化阶段和类肝细胞增殖阶段有表达,诱导率均为90%左右,说明类肝细胞已经形成;肝细胞功能性蛋白AAT和CYP3A4在类肝细胞成熟阶段有表达,诱导率分别为80%和90%左右,说明人iPSCs诱导类肝细胞具有人成熟肝细胞的主要功能特异性蛋白。3.qPCR对人肝特异性基因的检测结果:qPCR检测结果显示肝细胞特异性基因CK8、CK18、CK19、AFP、ALB在类肝细胞中有表达,相对于诱导前的细胞,人iPSCs诱导类肝细胞基因表达率明显升高。4.ICG摄取实验结果:ICG摄取实验显示诱导后的类肝细胞被染成绿色,说明人iPSCs诱导类肝细胞具有人肝细胞的特异性功能。5.雷公藤冻干粉对人iPSCs源的肝细胞的肝功能的影响:与0mg/mL的对照组比较,雷公藤冻干粉的1,2,4,8 mg/mL各干预组细胞培养液上清中的ALT和AST含量显著升高,呈剂量正相关性,差异具有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05);细胞中MDA的浓度显著升高,呈剂量正相关性,差异具有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05);细胞中GSH的浓度和SOD的活性显著降低,呈剂量负相关性,差异具有统计学意义(P＜0.01)。6.雷公藤冻干粉对L02细胞的肝功能的影响:与0mg/mL的对照组比较,雷公藤冻干粉的1,2,4,8 mg/mmL各干预组细胞培养液上清中的ALT和AST含量显著升高,呈剂量正相关性,差异具有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05);细胞中MDA的浓度显著升高,呈剂量正相关性,差异具有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05);细胞中GSH的浓度和SOD的活性显著降低,呈剂量负相关性,差异具有统计学意义(P＜0.01)。7.雷公藤甲素对人iPSCs源的肝细胞的肝功能的影响:与0 mg/mmL的对照组比较,雷公藤甲素的2,6,10,20 mg/mL各干预组细胞培养液上清中的ALT和AST含量显著升高,呈剂量正相关性,差异具有统计学意义(P＜0.01);细胞中MDA的浓度显著升高,呈剂量正相关性,差异具有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05);细胞中GSH的浓度和SOD的活性显著降低,呈剂量负相关性,差异具有统计学意义(P＜0.01)。8.雷公藤甲素对L02细胞的肝功能的影响:与0mg/mL的对照组比较,雷公藤冻干粉的1,2,4,8 mg/mL各干预组细胞培养液上清中的ALT和AST含量显著升高,呈剂量正相关性,差异具有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05);细胞中MDA的浓度显著升高,呈剂量正相关性,差异具有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05);细胞中GSH的浓度和SOD的活性显著降低,呈剂量负相关性,差异具有统计学意义(P＜0.01)。9.雷公藤冻干粉对人iPSCs诱导类肝细胞和L02细胞的肝功能的影响比较:人iPSCs诱导类肝细胞上清中的ALT和AST含量随着雷公藤冻干粉浓度的增高而升高,呈剂量正相关性,L02细胞上清中的ALT和AST含量随着雷公藤冻干粉浓度的增高而升高,呈剂量正相关性,雷公藤冻干粉对人iPSCs诱导类肝细胞膜毒性与雷公藤冻干粉对L02细胞的肝细胞膜毒性的作用趋势一致;人iPSCs诱导类肝细胞中MDA浓度随着雷公藤冻干粉浓度的增高而升高,呈剂量正相关性,L02细胞上清中MDA浓度随着雷公藤冻干粉浓度的增高而升高,呈剂量正相关性,雷公藤冻干粉对人iPSCs诱导类肝细胞膜脂质过氧化毒性与雷公藤冻干粉对L02细胞的肝细胞膜膜脂质过氧化毒性的作用趋势一致;人iPSCs诱导类肝细胞上清中的GSH的浓度和SOD活性随着雷公藤冻干粉浓度的增高而升高,呈剂量负相关性,L02细胞上清中的GSH的浓度和SOD活性随着雷公藤冻干粉浓度的增高而升高,呈剂量负相关性,雷公藤冻千粉对人iPSCs诱导类肝细胞内氧自由基清除酶毒性与雷公藤冻干粉对L02细胞的肝细胞内氧自由基清除酶毒性的作用趋势一致。10.雷公藤甲素对人iPSCs诱导类肝细胞和L02细胞的肝功能的影响比较:人iPSCs诱导类肝细胞上清中的ALT和AST含量随着雷公藤甲素浓度的增高而升高,呈剂量正相关性,L02细胞上清中的ALT和AST含量随着雷公藤甲素浓度的增高而升高,呈剂量正相关性,雷公藤甲素对人iPSCs诱导类肝细胞膜毒性与雷公藤甲素对L02细胞的肝细胞膜毒性的作用趋势一致;人iPSCs诱导类肝细胞中MDA浓度随着雷公藤甲素浓度的增高而升高,呈剂量正相关性,L02细胞上清中MDA浓度随着雷公藤甲素浓度的增高而升高,呈剂量正相关性,雷公藤甲素对人iPSCs诱导类肝细胞膜脂质过氧化毒性与雷公藤甲素对L02细胞的肝细胞膜膜脂质过氧化毒性的作用趋势一致;人iPSCs诱导类肝细胞上清中的GSH的浓度和SOD活性随着雷公藤甲素浓度的增高而升高,呈剂量负相关性,L02细胞上清中的GSH的浓度和SOD活性随着雷公藤甲素浓度的增高而升高,呈剂量负相关性,雷公藤甲素对人iPSCs诱导类肝细胞内氧自由基清除酶毒性与雷公藤冻干粉对L02细胞的肝细胞内氧自由基清除酶毒性的作用趋势一致。结论:1.人iPSCs细胞因子四步诱导分化方法可以将人诱导多能干细胞诱导分化成类肝细胞,分化成的类肝细胞具有肝细胞的形态,肝细胞的特异性蛋白,基因,肝细胞的特异性功能。2.雷公藤冻干粉对人iPSCs诱导类肝细胞的肝毒性作用趋势与雷公藤冻干粉对L02细胞的肝毒性作用趋势一致;雷公藤甲素对人iPSCs诱导类肝细胞的肝毒性作用趋势与雷公藤甲素对L02细胞的肝毒性作用趋势一致,提示人iPSCs诱导类肝细胞可以用于中药肝毒性检测。