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自体血管和人工合成血管是临床上主要的血管移植物,但自体血管因受来源限制,很难满足临床需求。人工合成血管材料如涤纶(Dacron)和膨胀聚四氟乙烯(ePTFE),在大直径血管(内径>6mm)移植中取得了较好的效果,但应用在小直径血管(内径<6mm)的移植中易导致内膜增生、血栓形成和阻塞等现象。血管组织工程技术为小直径血管移植物提供了新思路,制备理想的血管支架是血管组织工程重要的研究内容。
本研究在课题组前期将RGD-蛛丝蛋白(含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列,命名为pNSR32,分子量约为102KD)与聚己内酯(Polycaprolacton,PCL)共混,应用静电纺丝技术制备纳米纤维膜的基础上,添加亲水性良好的明胶(Gelatin,Gt),设计五组pNSR32/PCL/Gt三元共混材料体系,电纺结合旋转接收装置,制备pNSR32/PCL/Gt复合纳米纤维小直径血管支架,对所制备支架的理化性能进行表征并研究支架的生物相容性。
研究结果如下:
一、以Ⅰ型胶原酶消化与组织贴壁法相结合,建立了简单高效的Sprague-Dawley(SD)大鼠主动脉内皮细胞(SDRAECs)分离方法,倒置显微镜及伊红染色观察,分离的细胞呈多角形,铺路石状排列,为典型的内皮细胞形态。对内皮细胞特异性因子-Ⅷ因子免疫组织化学及免疫荧光染色,证实获得的细胞均为内皮细胞。
二、在前期pNSR32与PCL共混电纺的基础上加入Gt,改善支架的亲水性。以98％的甲酸为共同溶剂,设计五组配比(质量比)的共混体系:A组.pNSR32/PCL/Gt(0:100:0)、B组.pNSR32/PCL/Gt(5:95:0)、C组.pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)、D组.pNSR32/PCL/Gt(5:75:20)、E组.pNSR32/PCL/Gt(5:65:30)。电纺参数:纺丝液浓度30％,电压80kV,固化距离20cm,挤出速度80μL/min,转轴外径3mm,转轴转速2rpm,制备了长3cm、厚0.3mm、内径3mm的复合纳米纤维小直径血管支架。
三、对A-E五组配比制备的小直径血管支架的理化性能进行表征。测试了支架的纤维直径、孔径、孔隙率、吸水率以及接触角,发现随着Gt量的增加,支架纤维直径、孔径、孔隙率、吸水率均逐渐增大,接触角显著减小。傅立叶红外光谱(Fouriertransform infrared spectroscopy,FTIR)观察到pNSR32、PCL、Gt三者间无新化学键形成,乙醇处理未改变支架的构象；X-射线衍射(X-ray diffraction,XRD)结果证实pNSR32与Gt的加入可增加支架结晶度。pNSR32/PCL/Gt复合支架在PBS中的降解速率慢于多酶降解液,pNSR32与Gt的加入促进支架的降解速率,并与Gt的加入量成正相关。对C组配比支架的力学性能进行检测,结果为pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)支架在干燥状态下极限抗张强度2.67±0.22MPa,生理盐水浸泡24h后,极限抗张强度降为1.59±0.16Mpa,断裂伸长率从117％±15％上升至177％±13％,其缝合强度为3.6±1.2N,符合手术要求。
四、探讨A-E五组配比制备的小直径血管支架的细胞相容性。MTT比色法比较各组支架的细胞毒性,五组配比支架浸提液对SDRAECs均无毒性,毒级在1级以内,符合生物材料要求。SDRAECs与支架复合培养分析支架对细胞生长、增殖、周期及表型的影响,观察到Gt的加入改善了支架材料的细胞相容性,适宜的Gt含量(10％,C组)能提高支架的细胞相容性。具体结果:SDRAECs在C组配比支架细胞的增殖速率最快；SEM观察,DAPI染色及冰冻切片HE染色证实C组配比支架与A组,B组支架相比,能更好地支持SDRAECs粘附、生长、增殖；流式细胞技术检测C组配比支架可促进DNA复制,加速细胞增殖;免疫组化结果说明SDRAECs在C组配比支架上能正常表达Ⅷ因子；免疫荧光检测表明C组配比支架支架较组织培养板(Tissue culture plate,TCP)更有利于SDRAECs增殖及功能的维持。
五、探讨A-E五组配比制备的小直径血管支架的血液相容性。溶血试验结果表明A-E五组配比支架的溶血率分别为0.26％、0.13％、0.26％、0.55％、0.91％,均符合生物材料的溶血要求(<5％)。复钙化凝血时间实验观察到C组配比支架的复钙化时间与B组相似,但均比A组支架的时间长,说明C组、B组支架抗凝性能优于A组支架。动态凝血时间测定结果提示C组配比支架抗凝血能力较强。血小板黏附试验发现在C组配比支架上的血小板粘附数均较B组与A组支架少。综上结果,C组配比即pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)支架具有优良的血液相容性。
六、评价pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)复合纳米纤维小直径血管支架的遗传毒性。小鼠骨髓微核试验结果发现pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)支架浸提液的微核发生率为2.3‰±0.9‰,与生理盐水组(2.8‰±1.3‰)类似,显著低于环磷酰胺组(23.3‰±4.2‰)。单细胞凝胶电泳试验结果表明pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)支架浸提液没有造成SDRAECs的DNA损伤。
七、探讨pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)复合纳米纤维小直径血管支架的体内生物相容性。全身急性毒性试验结果表明pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)支架浸提液注射昆明小鼠体内后96h,小鼠未表现中毒症状,体重增加量与生理盐水对照组无显著差异(p>0.5)。pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)支架植入SD大鼠肌肉,30d后炎症反应与医用胶原对照组及空白对照组类似,炎症细胞基本消失,纤维囊壁趋向变薄,肌纤维结构排列有序,出现大量新生血管。对炎症程度评定均为1级,符合标准要求。
结论:Gt的加入改善了支架材料的性能,适宜的Gt含量(10％)能提高支架的生物相容性。pNSR32/PCL/Gt(5:85:10)复合纳米纤维小直径血管支架,理化性能良好,生物相容性优异,作为小直径血管组织工程支架材料应用于临床具有一定的可行性。