帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)是一类因中脑黑质致密部多巴胺能神经元丢失引起的多巴胺释放减少,进而导致机体运动功能障碍的神经退行性疾病。PD患者的症状随疾病的进程而不同,在运动症状出现之前患者即出现快动眼睡眠障碍、抑郁、焦虑、嗅觉减退以及便秘等非运动症状;而PD早期即表现出静止性震颤、运动迟缓和肌肉僵直等运动症状同时伴有轻微认知障碍、疲劳、白天过度嗜睡和冷漠;随着病情的进一步加重,患者开始出现轴向畸形、运动障碍、泌尿系统症状和直立性高血压等加重症状,并快速发展成易跌倒、痴呆、吞咽困难、姿势不稳及步态障碍,最终死亡[1]。临床上PD的治疗大多都基于提高脑内多巴胺含量和增加多巴胺生物利用度的治疗原则,然而这一治疗并不能治愈疾病,仅能缓解PD的症状、改善患者生活质量。因此,寻找引起多巴胺能神经元丢失的根本原因是PD治疗的重要前提。目前认为神经炎症、自噬溶酶体系统障碍、线粒体功能损伤、免疫失调、错误折叠蛋白聚集以及氧化应激等病理机制互为PD的诱发和加重因素,并导致多巴胺能神经元的丢失,共同参与PD的发生发展。近年来有学者提出氧化应激是这些致病因素中的始作俑者,并引起下游级联加重反应。DJ-1突变导致的线粒体氧化应激增加可引起多巴胺的氧化、进而导致溶酶体降解异常、引发α-synuclein聚集[2],加剧PD病理进程。由此认为在疾病早期的进行抗氧化干预是PD的重要治疗策略[3,4].多巴胺受体激动剂直接作用于多巴胺受体,可单独用于PD的治疗,尤其在PD早期和较年轻PD患者中疗效显著,可改善患者的运动障碍和波动症状。此外,多巴胺受体激动剂如卡麦角林、罗匹尼罗被报道还可通过促进脑内谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的生物合成来增强大脑抗氧化能力[5],但其促进GSH合成的分子机制尚不清楚。因为多巴胺为脑内重要的神经递质,前期关于多巴胺受体的研究多聚焦于神经元上的多巴胺受体。而研究发现在星形胶质细胞中也表达多巴胺受体,且其在调节神经炎症[6,7]、免疫功能[8]、神经递质释放[9]、钙稳态[10]等方面发挥重要作用,具有重要的生物学功能。因此本文第一部分旨在阐明多巴胺受体激动剂促进GSH合成的机制,结果显示星形胶质细胞多巴胺D2受体(Dopamine D2 receptor,Drd2)激活后可促进GSH的合成,而多巴胺D1受体(Dopamine D1 receptor,Drd1)激活对GSH的合成无影响。而神经元中不论是Drd1还是Drd2的激活对GSH合成均无影响,这可能与神经元中低表达丙酮酸激酶M2(Pyruvate Kinase M2 isoform,PKM2)有关。进一步探讨星形胶质细胞Drd2激动剂促GSH合成的机制,发现星形胶质细胞Drd2通过p-arrestin2直接结合并二聚化PKM2,继而二聚体PKM2激活Nrf2的转录活性,进而增强核因子红细胞2相关因子2(Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2,Nrf2)与其启动子谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(Glutamate-cysteine ligase catalytic subunit,Gclc)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基(Glutamate-cysteine ligase modifier subunit,Gclm)的结合,而Gclc、Gclm分别为GSH合成限速酶的两个亚基,最终促进GSH合成。在生理情况下多巴胺能神经元分泌释放多巴胺,激活星形胶质细胞Drd2,诱导PKM2二聚化,继而激活Nrf2转录活性,促进GSH的合成用以维持脑内氧化还原稳态。而在PD的病理情况下,多巴胺能神经元丢失,多巴胺分泌减少,星形胶质细胞Drd2激活减少,PKM2二聚化减少,Nrf2转录激活减少,由此GSH合成减少,造成ROS清除障碍,未被清除的ROS进一步损伤多巴胺能神经元,进而加剧多巴胺的分泌减少,如此往复形成损伤的恶性循环,加剧PD病理进程。目前临床上主要采用左旋多巴和多巴胺受体激动剂治疗PD,而这些药物在使用时出现了不尽如人意的副作用。如左旋多巴长时间使用疗效不佳、出现了开-关症状、异动症、运动控制障碍、嗜睡和多巴胺失调综合征等,同时在机体氧化应激的情况下,补充L-DOPA还会造成机体DA的氧化,生成毒性多巴醌进一步加重PD病理进程;多巴胺受体激动剂在长期使用后可导致的受体脱敏、内化,继而药物不能发挥治疗作用。这些现有药物均不能遏制恶性循环。同时基于第一部分阐明的星形胶质细胞Drd2促GSH合成的机制,我们在第二部分旨在绕过基于多巴胺的治疗方法,寻找能直接二聚化PKM2的小分子化合物,打破恶性循环。通过对863种小分子化合物进行筛选,寻找可直接二聚化PKM2的小分子化合物,发现pyridoxine可直接二聚化PKM2,进而激活Nrf2促进星形胶质细胞GSH的合成,这一作用能减轻小鼠1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)帕金森模型中多巴胺能神经元的丢失且不依赖于星形胶质细胞Drd2。结合第一、二部分阐明的星形胶质细胞中PKM2的神经保护作用和实验室前期的2D-PAGE-MS结果显示的1-甲基-4苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)刺激后神经元中PKM2出现从低到高的表达这一有趣现象,在论文第三部分我们进一步探讨了神经元PKM2的作用,发现MPP+/MPTP损伤后,神经元上调PKM2作为一种内源性的应激反应,通过外源性过表达PKM2扩大这一种自我保护作用可对抗MPTP导致的多巴胺能神经元丢失,在小鼠MPTP帕金森模型中发挥神经保护作用。第一部分 星形胶质细胞Drd2通过PKM2激活Nrf2转录活性促GSH合成目的:阐明多巴胺受体激动剂促进GSH合成的机制。方法:培养原代星形胶质细胞和原代神经元,单独予以多巴胺受体激动剂carbergoline刺激或者分别予以SCH23390和sulpiride预处理后再予以cabergoline刺激,试剂盒比色法检测GSH水平。培养WT和Drd2-/-的星形胶质细胞,予以quinpirole、quinelorane和bromocriptine刺激,试剂盒比色法检测GSH水平;Drd2flox、Drd2hGFAPcKO小鼠予以quinpirole或生理盐水腹腔注射后,试剂盒比色法检测纹状体GSH含量。WT小鼠经quinpirole或生理盐水腹腔注射,磁珠分选脑内星形胶质细胞后,进行转录组学测序寻找差异表达基因。Quinpirole刺激星形胶质细胞后,qRT-PCR检测Nrf2靶基因的mRNA表达、immunoblotting检测Gclc、Gclm的蛋白表达、ChIP检测Nrf2与靶基因Gclc、Gclm启动子的结合。培养WT和Nrf2-/-原代星形胶质细胞予以quinpirole刺激,immunoblotting检测Gclc、Gclm的蛋白表达、试剂盒比色法检测GSH水平。Label-free定量蛋白组学检测quinpirole刺激后星形胶质细胞中经Nrf2特异性抗体pull-down下拉的产物中变化的蛋白。qRT-PCR和选择性酶切实验检测原代神经元和原代星形胶质细胞中PKM1/PKM2的mRNA表达、immunoblotting检测其蛋白表达、TSA脑片多染检测PKM1/PKM2与NeuN/GFAP的共标情况。Lipo3000脂质体转染法敲减星形胶质细胞中PKM2后予以quinpirole刺激,qRT-PCR检测Gclc、Gclm的mRNA表达和Nrf2特异性抗体pull-down产物中Gclc、Gclm的水平、immunoblotting检测Gclc、Gclm的蛋白表达、试剂盒比色法检测GSH含量。星形胶质细胞经DASA预处理后予以quinpirole刺激,BN-PAGE检测PKM2构型变化、PLA和co-IP检测PKM2与Nrf2的相互作用、qRT-PCR检测Gclc、Gclm的mRNA表达和Nrf2特异性抗体pull-down产物中Gclc、Gclm的水平、immunoblotting检测Gclc、Gclm的蛋白表达、试剂盒比色法检测GSH含量。腺病毒AV-PKM1感染星形胶质细胞后予以quinpirole刺激,试剂盒比色法检测丙酮酸激酶活性、co-IP检测PKM1与Nrf2的相互作用、qRT-PCR检测Gclc、Gclm的mRNA表达和Nrf2特异性抗体pull-down产物中Gclc、Gclm的水平、immunoblotting检测Gclc、Gclm的蛋白表达。PTX刺激后或者分别敲减星形胶质细胞中β-arrestin1、β-arrestin2后予以quinpirole刺激,BN-PAGE检测PKM2构型变化、qRT-PCR检测Gclc、Gclm的mRNA表达和Nrf2特异性抗体pull-down产物中Gclc、Gclm的水平、immunoblotting检测Gclc、Gclm的蛋白表达,试剂盒比色法检测GSH含量。结果:1)Cabergoline呈浓度依赖性和时间依赖性促进星形胶质细胞GSH的合成,而对神经元GSH合成无影响。2)Drd1拮抗剂SCH23390对cabergoline诱导的星形胶质细胞GSH合成无影响,Drd2拮抗剂sulpiride可取消cabergoline的促星形胶质细胞GSH合成作用。3)Drd2激动剂(quinpirole、quinelorane和bromocriptine)呈浓度依赖性促进星形胶质细胞GSH合成,Drd2敲除可取消三种Drd2激动剂的作用。4)星形胶质细胞Drd2通过二聚化PKM2激活Nrf2促GSH合成。5)PKM1与Nrf2无相互作用,对Nrf2转录活性无影响。6)星形胶质细胞Drd2促进β-arrestin2与PKM2直接结合,二聚化PKM2。结论:星形胶质细胞Drd2激活促进GSH的合成,其机制与β-arrestin2二聚化PKM2后,二聚体PKM2激活Nrf2转录活性有关。第二部分 促PKM2二聚化的化合物筛选及其在帕金森病中的作用目的:筛选直接二聚化PKM2的小分子化合物并阐明其在帕金森病中的作用。方法:利用内源性色氨酸荧光差示技术筛选与PKM2纯化蛋白具有相互作用的小分子化合物,并通过BN-PAGE对筛选出的化合物进行进一步体外验证,检测其对PKM2纯化蛋白构型的影响。培养原代星形胶质细胞予以不同浓度的pyridoxine和vindoline刺激,高内涵细胞成像系统检测其对GSH生成的影响和对细胞的毒性作用。BN-PAGE检测pyridoxine对原代星形胶质细胞PKM2构型的影响,co-IP、PLA检测pyridoxine对原代星形胶质细胞中PKM2与Nrf2相互作用的影响。通过脂质体转染的方法敲减原代星形胶质细胞PKM2后予以pyridoxine刺激,qRT-PCR检测Nrf2特异性抗体pull-down产物中Gclc、Gclm的水平变化、immunoblotting检测PKM2的敲减效率和Gclc、Gclm的蛋白表达变化、试剂盒比色法检测GSH的水平变化。培养原代神经元并予以pyridoxine刺激,qRT-PCR检测Gclc、Gclm的mRNA表达变化、试剂盒比色法检测GSH的水平变化。Drd2flox/flox小鼠和Drd2hGFAPcKO小鼠分别予以pyridoxine、quinpirole和生理盐水腹腔注射,BN-PAGE检测纹状体PKM2的构型变化、qRT-PCR检测纹状体Gclc、Gclm的mRNA表达变化、immunoblotting检测纹状体Gclc、Gclm的蛋白表达变化、试剂盒比色法检测纹状体GSH的水平变化。Drd2flox/flox小鼠和Drd2hGFAPcKO小鼠制备MPTP亚急性PD模型并予以pyridoxine和quinpirole腹腔注射,TH免疫组化和尼式染色检测中脑TH阳性细胞数和尼式阳性细胞数的改变。结果:1)小分子化合物pyridoxine和vindoline可体外促进PKM2二聚化。2)离体星形胶质细胞中pyridoxine可促进星形胶质细胞GSH合成且无细胞毒副作用。3)Pyridoxine通过PKM2/Nrf2信号通路促进星形胶质细胞GSH合成。4)星形胶质细胞PKM2敲减抑制pyridoxine的促GSH合成作用。5)在体中pyridoxine可促小鼠纹状体GSH合成且这一作用不依赖于星形胶质细胞Drd2。6)Pyridoxine减轻小鼠MPTP亚急性PD模型中多巴胺能神经元丢失且这一作用不依赖于星形胶质细胞Drd2。结论:Pyridoxine通过PKM2/Nrf2信号通路促进星形胶质细胞GSH合成,在小鼠MPTP帕金森模型中发挥神经保护效应,且不依赖于星形胶质细胞Drd2。第三部分 神经元PKM2在帕金森病中的作用目的:阐明神经元PKM2在小鼠MPTP帕金森模型中的作用。方法:培养原代神经元予以MPP+刺激,immunoblotting检测PKM、PKM1和PKM2的蛋白表达;制备小鼠MPTP亚急性PD模型,TSA多染检测中脑TH神经元中PKM1、PKM2的表达变化。通过腺病毒AV-PKM2感染神经元用于过表达PKM2和培养PKM2敲除的原代神经元后予以MPP+刺激,CCK8检测细胞活力、LDH试剂盒比色法检测细胞损伤程度、Annexin V-FITC/PI流式检测细胞凋亡、MAP2染色检测神经元突起长度、Hoechst 33342染色检测细胞核形态学变化;中脑立体定位注射腺相关病毒分别制备神经元PKM2特异性过表达的小鼠和神经元PKM2敲减的小鼠后制备MPTP亚急性PD模型,TH染色计数检测中脑TH神经元丢失。AV-PKM1感染神经元过表达PKM1后,CCK8、LDH检测神经元PKM1过表达在MPP+损伤的神经元中的作用;BN-PAGE检测浓度梯度和时间梯度MPP+刺激后PKM2构型变化、过表达的PKM2的构型存在形式及DASA对PKM2构型的影响。CCK8、LDH试剂盒、Annexin V-FITC/PI流式、MAP2染色和Hoechst 33342染色检测DASA对MPP+损伤的神经元的作用。qRT-PCR检测过表达PKM2和DASA处理对Nrf2靶基因的mRNA水平的影响。结果:1)在体和离体实验中MPTP/MPP+均可诱导神经元中PKM1的下调、PKM2的上调。2)离体实验中,原代神经元过表达PKM2减轻MPP+诱导的神经元损伤细胞活力降低、LDH释放增多、凋亡增加、突起缩短和细胞核凝集、染色质固缩;而原代神经元中敲除PKM2则加重MPP+引起的神经元损伤。3)在体实验中,神经元特异性过表达PKM2减轻小鼠MPTP亚急性PD模型中脑TH神经元丢失而神经元PKM2特异性敲减加重小鼠MPTP亚急性PD模型中脑TH神经元丢失。4)神经元中过表达PKM1对MPP+损伤的神经元无显著影响。4)神经元过表达的PKM2以二聚体形式为主,二聚体PKM2通过激活Nrf2的转录活性,增强抗氧化基因转录发挥神经保护作用。结论:MPTP/MPP+诱导神经元损伤后,细胞上调PKM2作为一种应激保护机制对抗损伤;其机制与二聚体PKM2激活Nrf2转录活性有关。