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目的:为了将肺癌的靶向治疗和免疫治疗相结合,本研究扩增了VEGF-α-Gal融合基因,构建原核表达质粒pQE30-VEGF-α-Gal,在大肠杆菌M15内诱导表达rVEGF-α-Gal融合蛋白,并在体外细胞水平上研究重组蛋白的肺癌细胞靶向性和α-Gal表位介导的肿瘤细胞杀伤效应,为探索肺癌及其他肿瘤的新型靶向生物治疗途径奠定基础。
方法:
1.体外培养A549细胞,提取总RNA,以RT-PCR法扩增VEGF-α-Gal基因片段作为目的基因,双酶切后定向克隆入pQE30质粒中,构建并鉴定pQE30-VEGF-α-Gal原核表达质粒。
2.将pQE30-VEGF-α-Gal质粒转化进E.coli M15菌,用IPTG诱导目的蛋白表达,用SDS-PAGE法分析重组蛋白的相对分子质量及表达形式,用Western-blot法分析重组蛋白的抗原性,用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化重组VEGF-α-Gal融合蛋白,然后采取逐步降低尿素浓度的方法使重组蛋白复性。
3.通过细胞黏附试验评价重组蛋白中VEGF对肿瘤细胞A549的靶向性,通过血清杀伤试验分析重组蛋白中α-Gal模拟表位介导的体外溶肿瘤细胞效应。
结果:
1.经双酶切鉴定及DNA序列测定,证实pQE30-VEGF-α-Gal原核表达质粒构建成功。
2.将pQE30-VEGF-α-Gal质粒成功转化进E.coli M15菌,并实现目的蛋白的诱导表达。经SDS-PAGE法分析,目的蛋白分子量为18KDa,主要以包涵体形式为主。Western-blot结果表明,重组蛋白能分别与抗VEGF、抗α-Gal特异性结合。纯化的重组蛋白纯度约为90％。
3.细胞黏附试验和血清杀伤试验结果证实,纯化复性后的重组蛋白不但能黏附VEGFR+的A549细胞,而且其α-Gal模拟表位在人新鲜血清的参与下,对A549细胞产生了明显的溶细胞效应。
结论:
1.成功构建了原核表达重组质粒pQE30-VEGF-α-Gal,并成功表达及纯化了重组VEGF-α-Gal融合蛋白,为探索肿瘤生物治疗新途径奠定了基础。
2.重组VEGF-α-Gal融合蛋白不但具有VEGFR靶向性,还兼具α-Gal表位功能,为研究和开发新型靶向肿瘤生物制剂奠定了基础。