目的:本研究是在国家自然科学基金课题“独活香豆素联合转基因骨髓源神经干细胞治疗阿尔茨海默病的机制研究”（项目编号:81173580）资助下开展的。以APP/PS1双转基因小鼠为研究对象,首先利用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）,分析APP/PS1双转基因小鼠脑组织代谢指纹谱,硏究中药独活中活性单体蛇床子素（Osthole,Ost）对小鼠脑内小分子代谢物的影响,确定蛇床子素调控阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的作用机制,找到与蛇床子素抗炎抗氧化应激作用相关的信号通路;在此基础上,利用氧化应激细胞模型,体外探讨蛇床子素抗氧化应激的作用机制;利用转基因技术,构建神经营养因子3（neurotrophin-3,NT-3）高表达的骨髓源神经干细胞（bone marrow derived-neural stem cells,BM-NSCs）,体外探讨NT-3促进BM-NSCs向胆碱能神经元分化的机制;最后采用蛇床子素联合NT-3-BM-NSCs移植,探讨其对APP/PS1双转基因小鼠的治疗作用及机制,为有效治疗AD等神经系统难治性疾病开辟新的思路与途径。方法:1、将小鼠随机分为3组,分别为正常组（5月龄C57BL/6小鼠）、模型组（5月龄APP/PS1双转基因小鼠）和蛇床子素组（5月龄APP/PS1双转基因AD小鼠）。蛇床子素组灌胃给予蛇床子素20mg/kg,每日2次,连续6周,正常组和模型组灌胃给予等容量含CMC-Na的生理盐水。末次给药1h后脱颈椎处死各组小鼠,取其全脑,通过UPLC-MS技术和代谢组学的方法对脑组织样品进行分析。通过查询HMDB、KEGG等数据库和检索文献,寻找蛇床子素可能调控的内源性小分子差异代谢产物,分析相关的代谢通路,进而获得蛇床子素可能影响的与AD发病相关的信号通路。2、选取5-8周龄的C57BL/6小鼠,无菌条件下,取出其股骨及胫骨提取全骨髓细胞,裂解红细胞后置于多聚赖氨酸包被的24孔板中,加入含2%B27、20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）、20ng/mL表皮生长因子（EGF）和100U/mL青/链霉素的无血清培养基培养。待3-5周细胞增殖聚集形成神经球后,机械性吹打分散进行传代、扩增培养,用于后续实验。采用免疫荧光细胞化学法（Immunofluorescence cytochemistry,ICC）对其进行鉴定;将细胞分为3组,即正常组（不做任何处理）、模型组（加入500?M H₂O₂）和蛇床子素组（分别加入10?M、50?M、100?M蛇床子素预保护细胞24 h,再加入500?M H₂O₂）,在H₂O₂损伤细胞4h后,应用CCK-8法、LDH试剂盒及TUNEL法分别检测蛇床子素对H₂O₂损伤的BM-NSCs的保护作用;用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测蛇床子素对H₂O₂损伤的BM-NSCs中凋亡相关基因Bax、Bcl-2 mRNA表达的影响;免疫印迹法（Western Blot,WB）检测PI3K/Akt-1信号通路相关蛋白表达的变化,以探讨蛇床子素对H₂O₂损伤BM-NSCs的保护作用与该信号通路的相关性。3、NT-3高表达对体外培养BM-NSCs增殖分化的影响:将NT-3慢病毒转染小鼠BM-NSCs,建立高表达NT-3的BM-NSCs,应用ICC法、Western blot技术及ELISA法对NT-3的表达进行检测;取成功转染的BM-NSCs,将细胞分为3组,即正常组（不做任何处理）、GFP组（转染GFP）和NT-3组（转染NT-3）,溴脱氧尿苷（bromodeoxyuridine,BrdU）标记检测NT-3高表达对BM-NSCs增殖能力的影响;将3组细胞培养于神经干细胞分化培养基中,14天后ICC法检测胆碱能神经元特异性标志蛋白——胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransterase,ChAT）和运动神经元特异性标志蛋白——HB9的表达;RT-PCR法检测ChAT mRNA的表达;试剂盒法检测细胞上清液中乙酰胆碱（Acetylcholine,Ach）的含量;在细胞增殖和分化的不同阶段,分别采用RT-PCR法和Western blot法检测Notch信号通路相关基因和蛋白Hes 1、Mash 1及Ngn 1表达的变化,体外探讨NT-3高表达促进BM-NSCs向胆碱能神经元分化的分子机制。4、蛇床子素增强NT-3-BM-NSCs治疗AD的作用及机制研究:将小鼠随机分为5组,将NT-3-BM-NSCs或不含细胞的PBS移植入小鼠双侧海马,然后灌胃给予等容量的蛇床子素或含CMC-Na的生理盐水,连续给药6周。6周后,水迷宫法检测小鼠的学习记忆能力;ELISA法检测IL-6、IL-10和TNF-α等炎症因子表达;免疫组织化学法检测脑组织中ChAT蛋白的表达;Western blot法检测PI3K/Akt-1信号通路相关蛋白的表达。结果:1、偏最小二乘法判别分析（Partial least squares discrimination analysis,PLS-DA）结果表明,正常组、模型组和蛇床子素组能够区分开,3组小鼠在代谢层面上存在一定差异,同时,蛇床子素组小鼠能够向正常小鼠的方向恢复;蛇床子素组与模型组相比,差异代谢产物包括腺苷、黄嘌呤5-三磷酸、5-氨基咪唑核糖核苷酸、次黄嘌呤、腺嘌呤、1-（5’-磷酸核糖基）-5-甲酰胺基-4-咪唑甲酰胺、烟酸、烟酰胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺及1-酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱等;对差异化合物进行生物学信息分析,发现蛇床子素对APP/PS1双转基因小鼠调控的主要代谢通路有嘌呤代谢、烟酸和烟酰胺代谢、甘油磷脂代谢等;通过查询KEGG等数据库及文献检索,发现蛇床子素对APP/PS1双转基因AD小鼠调控的主要信号通路有PI3K、MAPK、Jak-SAKT、TGF-β等信号通路。2、从小鼠骨髓中提取的细胞培养于神经干细胞增殖培养基3-5周后,可被诱导形成神经球,细胞被机械性分散传代后,可继续增殖培养至10代以上。ICC法鉴定其表达神经干细胞特异性蛋白Nestin和Sox2,说明它们是未分化的神经干细胞;在神经干细胞分化培养基中培养14天,诱导其自然分化,免疫染色其分别表达NeuN、NG2、GFAP等蛋白,证明培养的BM-NSCs具有多向分化潜能;与模型组比较,50?M和100?M蛇床子素对细胞存活率的提高、LDH释放量及凋亡细胞数的减少有显著性差异（p<0.05）,说明蛇床子素对H₂O₂损伤的BM-NSCs有一定保护作用;RT-PCR实验结果表明,模型组中凋亡前基因Bax mRNA的表达增加,而抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表达减少（p<0.01）,与模型组相比,蛇床子素组中Bax mRNA的表达显著降低,而Bcl-2mRNA的表达显著增加,从而降低了二者之间的比值（p<0.01）;WB实验结果表明,模型组中PI3K和p-Akt蛋白的表达显著降低,与模型组比较,蛇床子素组中PI3K和p-Akt蛋白表达水平显著增加,而Akt蛋白表达则无显著性差异;在加入PI3K抑制剂LY294002后,减弱了蛇床子素对H₂O₂损伤BM-NSCs的神经保护作用,说明蛇床子素是通过激活PI3K/Akt-1信号通路抑制由氧化应激介导的BM-NSCs凋亡。3、NT-3高表达体外促进BM-NSCs增殖及向胆碱能神经元分化:NT-3基因转染BM-NSCs 3天后,在倒置荧光显微镜下可以观察到绿色荧光,说明转染成功。进一步采用ICC、Western Blot和ELISA法检测NT-3的表达情况,结果表明转染NT-3的BM-NSCs能高表达NT-3,而其他两组的NT-3只微弱表达,说明成功建立了高表达NT-3的BM-NSCs;与正常组和GFP组相比,NT-3组BrdU阳性细胞数显著增加（p<0.05）,说明NT-3高表达可促进BM-NSCs的增殖;ICC结果表明,与其他两组相比,NT-3组BM-NSCs可分化为更多的胆碱能神经元（p<0.01）,同时三组细胞中都没有检测到HB9的表达,说明分化的胆碱能神经元不是来源于脊髓运动神经元;RT-PCR实验结果表明,NT-3组细胞中ChAT mRNA的表达量显著增加,同时用试剂盒法检测到该组细胞上清液中Ach的释放量也显著增多（p<0.01）,这些结果均表明,NT-3高表达可促进BM-NSCs分化为胆碱能神经元,并能释放乙酰胆碱;RT-PCR和Western blot结果表明,在细胞增殖期,NT-3高表达能够上调BM-NSCs中Hes 1 mRNA和蛋白的表达,下调Mash 1、Ngn1 mRNA和蛋白的表达,而在细胞分化期,NT-3高表达则下调BM-NSCs中Hes 1mRNA和蛋白的表达,上调Mash 1、Ngn1 mRNA和蛋白的表达（p<0.01）,以上结果说明NT-3高表达是通过调节Notch信号通路来调控BM-NSCs的增殖与分化。4、蛇床子素促进NT-3-BM-NSCs存活及向胆碱能神经元分化治疗AD:水迷宫实验结果表明,蛇床子素联合NT-3-BM-NSCs移植可显著提高小鼠的学习记忆能力（p<0.01）;蛇床子素减少脑内炎症因子的表达,改善脑内微环境;蛇床子素能够促进移植的NT-3-BM-NSCs在脑内的存活、迁移,并向胆碱能神经元分化（ChAT表达增加,p<0.01）;其机制可能与激活PI3K/Akt-1信号通路有关。结论:1、独活中蛇床子素抗AD的作用机制可能与参与体内嘌呤代谢途径、烟酸和烟酰胺代谢、甘油磷脂代谢有关;调控的信号通路可能包括PI3K、MAPK、Jak-SAKT、TGF-β、磷脂酰肌醇等;2、独活中蛇床子素对H₂O₂损伤的BM-NSCs具有保护作用,能够提高BM-NSCs的存活率,减少LDH释放,抑制细胞凋亡,其作用机制可能与增加PI3K、p-Akt蛋白表达从而激活PI3K/Akt-1信号通路有关;3、NT-3高表达既可促进BM-NSCs的增殖,还可促进BM-NSCs分化为胆碱能神经元,其分子机制可能与调节Notch信号通路有关;4、蛇床子素联合NT-3-BM-NSCs移植可显著提高AD小鼠的学习记忆能力,改善脑内炎症微环境,促进移植的NT-3-BM-NSCs存活,增强脑内胆碱能神经功能,从而治疗AD。