细胞凋亡受到多条信号转导通路涉及的多种蛋白质-蛋白质相互作用(PPIs)的精密调控。细胞内PPIs异常是导致细胞凋亡途径受阻的重要因素。Bcl-2家族蛋白之间的PPIs和p53/MDM2的PPI分别调控不同的凋亡信号转导通路,是细胞凋亡通路中最受关注的PPIs。它们的相互作用界面都是一段α-螺旋,分别是Bcl-2家族蛋白的BH3螺旋和p53的TAD螺旋。在这些α-螺旋上,只有少量的氨基酸残基(hotspots)对PPI起到主要作用。因此,设计合成模拟α-螺旋上hotspots的空间位置和理化性质的小分子α-螺旋功能模拟物(Smαllmoleculeα-helixmimetics),能够实现对细胞凋亡通路中PPIs的调控,获得潜在的抗癌药物和重要的研究用探针工具。目前的小分子α-螺旋功能模拟物存在三个主要缺陷。第一,现有的小分子都只能实现对单个靶蛋白或同家族的PPIs靶蛋白的活性抑制,尚未实现一药多靶。然而,系统生物学和网络药理学研究表明对单一靶标的拮抗不足以广谱、有效杀死肿瘤细胞。第二,现有的小分子都只能通过解离PPIs抑制靶蛋白活性,无法同时干预靶蛋白水平。以BH3α-螺旋功能模拟物为例,它们无法像BH3-only蛋白一样在细胞内降低特定靶蛋白的水平,导致必须高浓度的小分子持续作用才能够有效抑制靶蛋白活性,增加了未来应用中发生毒副作用的风险。第三,现有的小分子无法在蛋白质组水平确认其靶标。由于PPI抑制剂与靶蛋白的亲和力远低于激酶抑制剂,很难以它们为基础设计基于活性的分子探针(Activity-basedProbes,ABPs),在活细胞内原位捕获靶蛋白,和在蛋白质组水平鉴定其药靶。这三点缺陷限制了小分子α-螺旋功能模拟物作为抗癌药物和分子探针的应用,因此发展多靶点PPIs抑制剂、研发促进靶蛋白降解的双功能PPI抑制剂和构建捕获PPIs的ABPs是本领域亟待解决的关键科学问题。首先,本研究通过分析Bim/Mcl-1、Bim/Bcl-2和p53/MDM2蛋白复合物晶体结构的异同,设计了能够同时模拟具有不同螺旋度的p53TAD和BimBH3 α-螺旋的hotspots的α-螺旋功能模拟分子骨架B。B具有骨架半刚性、取代基空间位置可变的分子特征。以B为基础,我们获得了首个能够同时以sub-μM亲和力结合Mcl-1、Bcl-2和MDM2蛋白的多靶点PPIs抑制剂B5。利用体外蛋白质活性检测(FP、ITC)、分子对接、蛋白质二维核磁(1H-15N HSQC)和细胞实验,我们证明了 B5能在肿瘤细胞内同时抑制Bax/Bcl-2、Bak/Mcl-1和p53/MDM2之间的相互作用,发挥基于p53和Bcl-2介导的两个信号转导通路的抗肿瘤活性。其次,本研究设计合成了首个双功能α-螺旋功能模拟分子E5。E5不仅能够解离Mcl-1蛋白参与形成的PPIs,还能够促进Mcl-1蛋白构象依赖的泛素化降解。利用E5及其衍生物的构效关系分析,结合限制性酶切实验和质谱测序分析、表面等离子体共振实验(SPR)、蛋白复合物结晶、X-射线晶体衍射实验、蛋白质三维核磁实验、泛素化检测和细胞生物学实验,我们证明了 Q221R222N223motif是Mcl-1蛋白与BH3-only蛋白发生分子识别的结构基础。H224残基是调控Q221R222N223 motif的螺旋-非螺旋构象的“分子开关”,E5通过-COOH取代基与Mcl-1蛋白的H224残基形成盐桥和氢键,诱导QRN motif形成螺旋构象,利于泛素连接酶Mule的结合,并促进泛素化降解,更高效地诱导Mcl-1依赖的肿瘤细胞的凋亡。最后,本研究通过分析PPI靶标蛋白与小分子抑制剂的结合模式,设计了一种新型的适用于在蛋白质组水平原位捕获PPIs靶标蛋白的“分叉型”光交联linker L1,并利用L1构建了基于活性的分子探针C2,首次实现了 Bcl-2家族蛋白在蛋白质组水平的原位靶标确认。我们利用C2在体外和活细胞内分别捕获和荧光标记了已知的Bcl-2蛋白,证明L1捕获PPIs靶点的效率高于目前广泛应用的“minimalist”linker。同时,我们还发现微管蛋白可能是Bcl-2抑制剂的潜在药靶,初步证明了微管蛋白是一个含有类似BH3沟槽的Bcl-2-like蛋白。