典型的伤口愈合过程包括炎症期、血管生成和肉芽组织形成期、再上皮化和结缔组织重构等阶段,其中角质形成细胞的增殖及上皮化是伤口封闭的中心环节。围绕促进角质形成细胞增殖这一关键点,衍生出了各式各样的局部治疗技术及药物。银、铜、锌等金属制剂及敷料长期以来在烧伤创面的局部治疗中发挥着重要作用。为深入探究它们的细胞生物学效应,我们以硝酸银、硝酸铜对人角质形成细胞增殖的影响为例,开展了相关的研究工作。大量的体外实验证实Ag+及Cu2+在≥1×10-4 M浓度下均存在不同程度的细胞增殖毒性,体内实验也报道了高浓度含银制剂及敷料对创面愈合的负面影响。然而,在亚细胞毒浓度下,Ag+、Cu2+对细胞虽无增殖毒性,但细胞内活性氧(ROS)产生却明显增加。这部分增加的细胞内活性氧所产生的细胞生物学效应尚不明确。众所周知,ROS除了参与细胞凋亡、坏死,还可作为重要的信号分子,参与细胞信号转导,转录因子激活,从而影响基因的表达,促进细胞的增殖和分化。据此,我们通过前期的预实验发现,亚细胞毒浓度的Ag+、Cu2+能够在特定的浓度范围内既促进角质形成细胞增殖,又同时诱导细胞内ROS的产生。综上所述,我们假设不同浓度的Ag+、Cu2+对诱导人角质形成细胞ROS产生具有不同的影响,这也进一步向下游传导影响人角质形成细胞的增殖活性,且Ag+、Cu2+在ROS产生的双向性剂量-效应关系上相互契合。本研究以不同浓度Ag+、Cu2+对人永生化角质形成细胞系(Ha Ca T细胞)增殖功能的影响为观察重点,运用活性氧清除剂NAC寻找并验证其与细胞内ROS生成上调的相互关系。同时,运用i TRAQ技术寻找组间差异蛋白,进一步通过生物信息学分析其功能富集情况,预期初步明确Ag+、Cu2+作用下角质形成细胞增殖相关的潜在分子靶点。1.研究目的本研究拟观察不同浓度Ag+、Cu2+对人角质形成细胞增殖功能影响,检测其诱导细胞内ROS产生能力,采用活性氧清除剂验证ROS在亚细胞毒浓度Ag+、Cu2+促增殖效应中扮演的角色,利用高通量的i TRAQ技术筛选差异蛋白并做功能注释和富集分析,寻找细胞增殖及ROS生成相关的潜在分子靶点,为进一步研究Ag+、Cu2+影响角质形成细胞增殖功能的作用机制提供实验依据。2.研究方法2.1 Ag+对人角质形成细胞增殖功能及细胞内ROS生成的影响2.1.1采用CCK-8法检测不同浓度Ag+和(或)活性氧清除剂(NAC)对人角质形成细胞增殖功能的影响,鉴别Ag+的细胞毒性浓度与亚细胞毒浓度;对特定的亚细胞浓度进行Brd U掺入、PCNA表达、细胞周期等实验检测,以验证细胞增殖活性改变。2.1.2通过DCFH-DA荧光分析检测不同浓度Ag+和(或)NAC对人角质形成细胞内ROS产生水平的影响。2.1.3应用i TRAQ蛋白质定量技术筛选亚细胞毒浓度Ag+作用下人角质形成细胞的差异蛋白,并对所有差异蛋白质做功能注释和富集分析。2.2 Cu2+对人角质形成细胞增殖及小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响2.2.1采用CCK-8法检测不同浓度Cu2+和(或)NAC对人角质形成细胞增殖功能的影响。2.2.2通过DCFH-DA荧光分析检测不同浓度Cu2+和(或)NAC对人角质形成细胞内ROS产生水平的影响。2.2.3应用i TRAQ蛋白质定量技术筛选亚细胞毒浓度Cu2+作用下人角质形成细胞的差异蛋白,并对所有差异蛋白质做功能注释和富集分析。2.2.4采用雄性BALB/c小鼠全层皮肤缺损创面模型评价不同浓度Cu2+对创面愈合的影响。3.研究结果3.1 Ag+对人角质形成细胞增殖功能及细胞内ROS生成的影响3.1.1 10-6 M、10-5 M Ag+在24 h、48 h和72 h均能明显促进Ha Ca T细胞增殖,细胞相对增殖率约103.18%~118.76%(P值均<0.05),在24 h~120 h的各个时相点上,10-8 M、10-7 M Ag+对Ha Ca T细胞增殖无明显影响,细胞相对增增殖率约99.24%~104.65%(P值均>0.05),而10-4 M Ag+造成细胞在短时间内完全死亡,OD值波动在0.263~0.283,接近于空白值;10-6 M、10-5 M Ag+作用Ha Ca T细胞48 h后Brd U阳性细胞数增加,PCNA免疫荧光增强,10-5 M Ag+还显著升高细胞的增殖指数(PI)。3.1.2 10-6 M、10-5 M Ag+处理Ha Ca T细胞后,在5 min~60 min时间点上细胞内ROS产生显著增强;加入5 m M NAC共培养后,细胞内ROS产生明显减少;加入5 m M NAC共培养后,10-6 M、10-5 M Ag+的促增殖效应消失。3.1.3在10-6~10-4 M范围内进一步细分筛选发现7.5×10-6 M浓度下Ag+具有最佳的促增殖作用;对0 M、1×10-7 M、7.5×10-6 M浓度Ag+处理48 h的Ha Ca T细胞样品进行i TRAQ蛋白定量,通过对组间差异蛋白进行生物信息学分析发现:7.5×10-6 M Ag+组和1×10-7 M Ag+组除在多样化微生物代谢、氨酰基t RNA合成等通路富集外,在核糖体通路的差异蛋白富集率达15.15%(40/264)、16.58%(33/199),且全部为上调;在糖酵解/糖异生、三羧酸循环、磷酸戊糖途径、次生代谢物生物合成、乙醛酸和二元羧酸等众多碳水化合物代谢相关的通路均有显著富集。此外,7.5×10-6 M Ag+组在RNA转运、细胞外基质受体相互作用及半胱氨酸和蛋氨酸代谢等通路上具有自身独特的富集表现。3.2 Cu2+对人角质形成细胞增殖及小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响3.2.1与阴性对照(0 M Cu2+)相比,10-6、10-5 M Cu2+处理48 h后Ha Ca T细胞相对增殖率分别显著升高至116.19%(P=0.027)、113.37%(P=0.036),5 m M NAC能拮抗其促增殖作用。10-4 M Cu2+组表现出明显的细胞毒性,相对增殖率下降至12.20%(P=0.001);进一步上升至10-3 M时,细胞在短时间内几乎完全死亡,OD值仅为(0.05±0.21,P<0.01),基本接近于空白值。3.2.2与阴性对照(0 M Cu2+)相比,10-6、10-5、10-4 M组Cu2+处理Ha Ca T细胞30 min后其细胞内ROS产生达到127.47%(P=0.001)、124.28%(P=0.031)、125.60%(P=0.004),60 min后进一步上升至140.47%(P=0.002)、134.29%(P=0.007)、130.66%(P=0.007);10-8、10-7 M Cu2+在处理后60 min也刺激Ha Ca T细胞内ROS产生明显升高至110.99%(P=0.016)及117.34%(P=0.016);加入5 m M NAC共培养后,细胞内ROS产生明显减少。3.2.3对0 M、1×10-7 M、1×10-6 M浓度Cu2+处理48 h的Ha Ca T细胞样品进行i TRAQ蛋白定量,通过对组间差异蛋白进行生物信息学分析发现:1×10-7 M Cu2+组和1×10-6 M Cu2+组在糖酵解/糖异生、三羧酸循环、磷酸戊糖途径、丙酮酸代谢、脂肪酸代谢等通路显著富集,其中在核糖体通路的差异蛋白富集率达12.07%和26.24%,且全部为上调;此外,1×10-6 M Cu2+组在谷胱甘肽代谢及半胱氨酸、蛋氨酸代谢途径上,差异蛋白上调率高达88.89%(8/9),但两条通路上富集的差异蛋白数合计仅占总差异蛋白数的2.36%(9/381)。3.2.4与阴性对照(0 M Cu2+)相比,10-6 M Cu2+水凝胶敷料在第6、8、10 d能够显著提高小鼠全层皮肤缺损创面愈合率;10-8 M Cu2+组在第8、10 d创面愈合率也显著升高;10-4 M Cu2+组的创面愈合率在第2~12 d各个时相点上与对照组无明显差异,但其在第8、10 d与10-6 M Cu2+组之间存在明显差异。4.2 10-6~10-5 M的Ag+、Cu2+均能在作用48 h后促进Ha Ca T细胞增殖,浓度为7.5×10-6 M Ag+,1×10-6 M Cu2+具有最佳的促增殖作用。4.3在亚细胞浓度范围内,细胞内ROS产生随Ag+、Cu2+浓度增加而增加;活性氧清除剂NAC能够降低细胞内ROS水平,同时拮抗亚细胞毒浓度Ag+、Cu2+的促增殖效应,且ROS变化水平与细胞相对增殖率呈正相关。4.4蛋白组学分析显示:(1)亚细胞毒浓度Ag+处理后可能引起Ha Ca T细胞碳水化合物代谢及蛋白质合成增加,可能经生物氧化过程增加ATP和ROS生成,进一步由ROS激活下游的ERK1/2、JNK等通路,调节转录因子的表达,促进细胞增殖;(2)亚细胞毒浓度Cu2+处理Ha Ca T细胞后,在糖酵解/糖异生、三羧酸循环、磷酸戊糖途径、丙酮酸代谢、脂肪酸代谢等众多能量代谢相关的通路均有显著富集,在核糖体通路的差异蛋白富集率更达到12.07%和26.24%,且全部为上调,可能伴随蛋白质翻译合成的增加。1×10-6 M Cu2+组在谷胱甘肽代谢及半胱氨酸、蛋氨酸代谢途径等巯基化合物代谢通路上调可能间接反映了ROS产生的增加;(3)然而,两者尚缺乏在细胞增殖及ROS产生等主要经典通路上的直接证据,有必要在下一阶段继续就现有通路改变进行上下游关系验证。4.5亚细胞毒浓度Cu2+敷料在特定时间段能够促进小鼠全层皮肤缺损创面模型的创面愈合。4.结论4.1≥1×10-4 M的Ag+、Cu2+对Ha Ca T细胞均存在不同程度的细胞毒性。