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目的 严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）大流行以及其所带来的对全球人口结构冲击和对经济破坏性的影响,标志着继重症急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）之后的第三次高致病性冠状病毒威胁人类。尽管之前的SARS-CoV和MERS-CoV流行提高了人们对临床治疗或预防干预措施的认识,但迄今为止,尚无有效的预防手段可用。并且就感染人数和疫区空间范围而言,SARS-CoV-2导致的疫情都已经压倒性地超过了 SARS和MERS所引起的传染病。SARS-CoV-2具有高度传染性、广泛的组织嗜性、极易变异的特性,它的扩散蔓延对全球公共卫生系统构成了巨大威胁。迄今为止,各国依靠隔离、检疫和对受影响个体的临床护理来控制该疾病快速传播。面对病毒肆虐,SARS-CoV-2疫苗研发以及接种对于防止SARS-CoV-2感染以及减弱病情显得尤为重要。然而在疫苗的研发过程中抗体依赖性增强效应（ADE）是非常重要的一个问题,即非中和或者亚中和抗体与病毒表面蛋白结合并促进病毒侵入宿主细胞。含量丰富、相对稳定的主要结构蛋白被普遍认为是能够诱导产生抗体的抗原,SARS-CoV-2的4种主要结构蛋白中,S和N蛋白具有明显的免疫原性。对于M蛋白,目前的研究较少关注。那本研究旨在探寻SARS-CoV-2病毒中含量最为丰富的结构蛋白——膜蛋白（M）引起的免疫特征,尤其是引发ADE效应的可能性。方法本研究利用原核表达系统构建可以表达SARS-CoV-2全长膜（Membrane,M）蛋白的重组质粒pET-32a-M,在BL21细胞中以IPTG诱导表达,经溶菌酶处理、超声破碎、尿素洗涤、切胶、透析、浓缩制备纯化的携带有His标签的全长M蛋白。该纯化的重组蛋白（50 u g/只）与弗氏佐剂混合,经皮下途径分三次（第1、14和21天）免疫正常BALB/c小鼠,分别采集分离免疫前、免疫1次、2次以及3次的免疫血清。通过Western blotting鉴定血清抗体的特异性,并采用ELISA法和中和实验对血清抗体的效价进行检测。之后从正常BALB/c小鼠的脾脏中分选树突状细胞（dendritic cell,DC）、自然杀伤细胞（natural killer cell,NK）、T 淋巴细胞（T-lymphocyte）和B淋巴细胞（B-lymphocyte）,将不同浓度抗M蛋白血清加到上述细胞中,随后感染SARS-CoV-2,利用体外培养技术检测感染后12h、24h以及48h病毒在这些免疫细胞中的复制增殖情况以及诱导的与天然免疫激活相关的细胞因子表达变化情况。结果我们构建了pET-32a-M的原核表达载体,通过1mM IPTG诱导的方式诱导大肠杆菌表达系统表达全长M蛋白。通过SDS-PAGE证实大肠杆菌表达系统能够成功表达M蛋白,并且原核表达的M蛋白主要聚集在包涵体中。随后我们使用4M碳酰胺处理超声沉淀,去除杂蛋白,并且对目的蛋白进行切胶纯化,通过透析获得较为纯净的M蛋白。利用弗氏佐剂将纯化浓缩的M蛋白按照50 μg/只的剂量皮下免疫小鼠3次,并于加强免疫前通过尾静脉取血方式分离获得小鼠血清,在初免后第28天（末次免疫7天后）通过眼球取血方式分离获得小鼠血清。实验结束时小鼠以安乐死方式麻醉处死。利用ELISA法检测使用纯化的SARS-CoV-2全长M蛋白免疫BALB/C小鼠获得的免疫血清的抗体效价约1:200。利用Western Blot对获得的免疫血清进行特异性检验,证实免疫血清可以特异的识别新冠病毒的M蛋白。另外,利用中和实验检测该免疫血清中和新冠病毒的能力,结果发现所制备的抗M蛋白的抗体其中和效价＜1:4（为阴性）。进一步,利用体外培养技术,从空白健康BALB/c小鼠的脾脏中分选DC、NK、T和B细胞,在不同浓度抗M蛋白血清存在的情况下,以SARS-CoV-2（moi=0.01）分别感染DC、NK、T和B细胞,PCR方法检测感染12h、24h以及48h后病毒增殖情况。结果发现在不同稀释度的抗血清存在的情况下,无论是在B、DC细胞中还是在NK、T细胞中,病毒载量与病毒对照组（无抗血清）类似,且在感染12-48h内没有显著的增长趋势。同期的缺乏Fc受体（FcR）的Vero细胞对照中,不同稀释度的抗血清存在下的病毒载量亦与病毒对照组（无抗血清）类似,且在感染24h开始出现小幅度的增长趋势。另外,我们亦检测了病毒感染上述细胞后,与天然免疫相关的细胞因子的表达水平。结果显示,不同类型免疫细胞感染新冠病毒的实验组（不同稀释度的抗血清存在）中各种因子的表达水平与相同细胞的病毒对照感染组（无抗血清）中表达水平类似或者更低。结论我们以原核表达系统成功制备了新冠病毒全长M蛋白,并利用该蛋白免疫小鼠制备抗M蛋白抗血清,该血清能够特异识别新冠病毒的M蛋白,并且抗体效价约1:200,但是它是一种没有中和能力的非中和抗体。这种由M蛋白诱导的非中和抗体不能够辅助病毒感染各种类型具有Fc受体（FcR）的免疫细胞并在其中增殖或诱导异常免疫反应,即其不能够通过FcR途径诱导ADE效应。