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目的:本研究以大肠埃希菌（Escherichia coli,E.coli）ST131克隆株为研究对象,了解E.coli ST131克隆株的流行状况,分析其分子生物学特征,为预防和控制感染的暴发流行及其引起的感染性疾病的治疗提供实验依据。方法:1.菌株收集及E.coli ST131克隆株筛查:收集福建医科大学附属协和医院检验科细菌室2014年8月至2015年8月临床分离非重复E.coli菌株。采用PCR扩增针对E.coli ST131特异性gyrB和mdh基因、系统发育分型基因（ChuA、YjaA、TspE4.C2）和O血清型的分子分型基因（O1、O2、O4、O6、O7、O8、O15、O16、O18、O21、O22、O25、O25b、O75、O83、O157）,根据Achtman方案,使用7个管家基因（adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA and recA）（http://mlst.ucc.ie/mlst/dbs/Ecoli）对所有非O25b,非O16和非系统发育分型B2群E.coli ST131克隆株采用多位点序列分型（MLST）去验证是否为E.coli ST131克隆株。2.fimH基因的分型:用fimH30等位基因特异性引物进行H30及H30 Rx-ST131鉴定。采用fimH SNP对所有H30-ST131 PCR阴性克隆株进行分型。3.毒力基因检测:采用多重PCR扩增26对毒力基因（papAH、papC、papEF、papGⅡ/Ⅲ、papGalleleⅠ、papGalleleⅡ、sfa/focDE、afa/draBC、fimH、gafD、sfaS、focG、hlyA、cnf1、cdtB、fyuA、iutA、kpsMTⅡ、kpsMTⅢ、traT、cvaC、K1/K5、rfc、PAI）,分析E.coli ST131克隆株携带毒力因子的情况。4.药敏试验:采用K-B法对E.coli ST131克隆株进行药物敏感性试验,药物包括:头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、环丙沙星、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、复方新诺明、亚胺培南、厄他培南、左氧氟沙星。结果根据2016年CLSI标准的折点进行判读。大肠埃希菌ATCC 25922用于常规质量控制。5.常见β-内酰胺酶基因检测:采用PCR法检测E.coli ST131克隆株的常见β-内酰胺酶耐药基因(blaCTX-M、blaTEM和blaSHV)。6.喹诺酮类耐药机制检测:选择环丙沙星耐药菌株,通过PCR法检测（1）质粒介导的喹诺酮耐药基因（PMQR）包括:qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS和aac（6’）-Ib-cr;（2）染色体介导的喹诺酮耐药决定区基因（QRDR）中基因突变包括:gyrA、parC和parE。7.同源性分析:对E.coli ST131克隆株进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析。根据Dice相关系数的不加权配对组方法,用BioNumerics软件构建PFGE聚类树状图。8.统计学分析:使用SPSS 19.0软件进行统计分析。使用χ2或Fisher确切概率法检验进行分析比较。P<0.05被认为是差异具有统计学意义。结果:1.E.coli ST131克隆株筛查:临床分离700株E.coli共筛查出83株（11.6%）E.coli ST131克隆株。系统发育分型表明全部E.coli ST131克隆株均为B2群。O血清型的结果显示E.coli ST131克隆株属于两种类型,O25b（55/83）和O16（28/83）。2.H30-ST131占E.coli ST131克隆株的63.9%（53/83）,分别为13株H30 Rx-ST131和40株H30 non-Rx-ST131克隆株;剩余的30株属于H41-ST131克隆株。94.5%O25b-ST131克隆株（52/55）含有fimH30等位基因,96.4%的O16-ST131克隆株（27/28）含有fimH41等位基因。3.毒力基因检测:E.coli ST131克隆株中检出率高于60%的毒力基因依次为fimH（98.8%）、fyuA（97.6%）、iutA（92.8%）、PAI（91.6%）、traT（88.0%）和kpsMT II（74.7%）;相反,检出率低于10%的毒力基因有11个,包括cvaC（3.6%）、sfa/focDE（1.2%）、sfaS（8.4%）、afa/draBC（8.4%）。未检出的毒力基因有以下7种:focG、papGallele I、gafD、cdtB、kpsMTIII、nfaE和rfc。毒力基因papAH、papC、papEF、papG allele II、papGⅡ∕Ⅲ、afa/draBC和kpsMT K5在O25b-ST131克隆株的流行性显著高于O16-ST131克隆株（P<0.05）。H30 Rx-ST131克隆株的毒力分数（毒力基因的个数）显著高于H30 non-Rx ST131和H41-ST131克隆株（P<0.05）。毒力基因papAH、papC、papEF、papG allele II、papGⅡ∕Ⅲ、hlyA和cnf1在H30 Rx-ST131克隆株的流行性显著高于H30 non-Rx ST131和H41-ST131克隆株（P<0.001）。毒力基因kpsMT K5在H30-ST131克隆株的流行性高于H41-ST131克隆株（P<0.05）。4.药敏试验结果:E.coli ST131克隆株对11种常见抗菌药物产生不同程度的耐药,对头孢噻肟（71.7%）、环丙沙星（69.9%）、左氧氟沙星（69.9%）和复方新诺明（67.5%）耐药率较高,而对氨曲南（36.1%）、头孢吡肟（31.3%）、头孢他啶（26.5%）、阿米卡星（8.4%）和哌拉西林/他唑巴坦（1.2%）耐药率较低,对亚胺培南和厄他培南敏感。多重耐药菌检出率为55.4%（46/83）。与O25b-ST131克隆株相比,O16-ST131克隆株对氟喹诺酮类药物（如环丙沙星和左氧氟沙星）和头孢吡肟的耐药率较低（P<0.05）。与H41-ST131克隆株相比,所有的H30non-Rx和H30 Rx-ST131克隆株对氟喹诺酮类药物（如环丙沙星和左氧氟沙星）的耐药率高（P<0.001）。与H30 Rx-ST131克隆株相比,H41-ST131和H30 non-RxST131克隆株对头孢他啶和头孢吡肟和氨曲南的耐药率较低（P<0.01）。5.常见β-内酰胺酶基因的检测结果:PCR检测结果显示,83株E.coli ST131克隆株中有34株携带blaTEM-1。对头孢噻肟或头孢他啶不敏感的E.coli ST131克隆株中有62株携带blaCTX-M,其中37株携带blaCTX-M-14,22株携带blaCTX-M-15,1株携带blaCTX-M-123,其余2株同时携带blaCTX-M-14和blaCTX-M-15。本研究中未检出blaSHV、CTX-M-2组、CTX-M-8组及CTX-M-25组。与H30 non-Rx ST131和H41-ST131相比,H30 Rx-ST131携带更多的blaCTX-M-15（P<0.001）。与H30 Rx相比,O16-H41ST131和O25b-H30 non-Rx ST131克隆株携带更多的blaCTX-M-14和blaTEM-1（P<0.001）,而H30 Rx-ST131不携带blaCTX-M-14和blaTEM-1。CTX-M-15-H30 Rx组头孢吡肟和阿米卡星的耐药率高于CTX-M-14-H30R组（P<0.001）。6.喹诺酮类耐药机制检测结果:在17株（20.5%）E.coli ST131克隆株中发现三种类型的PMQR基因,包括aac（6’）-Ib-cr（18.1%,15/83）、qnrS1（2.4%,2/83）、qnrB1（2.4%,2/83）,两株同时携带qnrB1和aac（6’）-Ib-cr。58株耐环丙沙星的E.coli ST131克隆株中每株菌均含有4至5个非同义突变,这些非同义突变主要来自gyrA、parC和parE中氨基酸突变。所有58株耐环丙沙星的E.coli ST131克隆株都有一组3个保守的QRDRs基因氨基酸替代（GyrA Ser83→Leu,Asp87→Asn和ParC Ser80→Ile）。H30Rx和H41-ST131的aac（6’）-Ib-cr阳性率显著高于H30non-Rx（P<0.001）。H30-ST131克隆株中存在5个位点突变（GyrA S83→L,D87→N,ParC S80→I,E84→V和ParE I529→L）显著高于H41-ST131克隆株（P<0.001）。7.同源性分析:PFGE分析表明,83株E.coli ST131克隆株可分为68个型（命名为168）。使用70%相似度,这些亚型被分为23个不同PFGE簇（AW）。两个PFGE簇（C簇和D簇）占主导地位,分别含有13和14个菌株,而另外21个PFGE簇分别包含多达9个菌株。C簇含有92.3%（12/13）H30 Rx-ST131克隆株,大部分O16 ST131克隆株属于两个簇（H簇和I簇）,分别含有5和9个E.coli ST131克隆株。结论:1.这是中国首次报道连续收集未经选择的临床E.coli菌株中ST131克隆株的流行情况和分子生物学特征。2.本研究E.coli ST131克隆株流行率较低,系统发育分型属于B2群。H30-ST131占E.coli ST131克隆株的绝大多数,是ST131亚克隆的重要谱系。3.O16-B2-ST131克隆株可能是中国E.coli ST131克隆株的一个重要类型。4.fimH、fyuA、iutA、kpsMTII和traT是本研究中最常见的E.coli ST131克隆株五种毒力因子。5.E.coli ST131克隆株是多重耐药ExPEC的主要克隆群。6.H30 Rx-ST131与多重耐药性和blaCTX-M-15的存在密切相关。7.E.coli ST131克隆株耐氟喹诺酮类药物的机制主要与QRDR染色体突变,特别是与GyrA和ParC亚基的突变密切相关。8.E.coli ST131克隆株的PFGE聚类分析结果显示菌株间呈现多样化分布,在遗传特征上表现出高度的多样性,没有主要的克隆。