乳腺癌是全球女性最好发的恶性肿瘤，其发病率和死亡率存在明显的地区差异。在我国，乳腺癌的发病率呈现出明显在上升的趋势，部分城市报道乳腺癌已跃居至女性癌症之首。乳腺癌的病因繁多，其发生和发展是一个繁杂的过程，目前研究尚未完全明确。随着研究的不断深入，人们发现表观遗传的修饰对于乳腺癌的发生和发展具有重大的意义。由PcG蛋白复合体所介导的基因转录沉默目前是表观遗传修饰的研究重点，其中PcG蛋白复合体分为两个核心蛋白复合体：PRC1和PRC2。本课题所研究的EZH2是PRC2蛋白复合体的核心成员之一。EZH2不仅在浸润性和转移性乳腺癌中被检测到高表达，甚至在原位癌中也被检测到有高表达，可见EZH2和乳腺癌的发生、发展、浸润与转移密切相关。
　　前期实验我们分别提取了不同乳腺癌细胞系中的RNA及总蛋白，通过RT-pcr、western-blot实验来检测EZH2在不同细胞系中的表达情况，发现在三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞株中EZH2为高表达，于是选择该细胞株来构建敲减EZH2基因表达的稳转细胞株。在此基础上，我们进一步研究了在敲减EZH2基因表达后所引起的乳腺癌细胞发生的生物学行为改变，从而阐述EZH2和乳腺癌的关系。我们主要采用CCK-8、划痕、transwell迁移实验，对敲减EZH2表达后的MDA-MB-231细胞的增殖、迁移以及细胞周期进行了研究。结果显示：在CCK-8实验中，干扰EZH2表达的稳转细胞的增殖能力相比对照组减弱，而在划痕和transwell迁移实验中，同样发现敲减组的稳转细胞迁移能力较对照组下降。因此，EZH2基因敲减表达后会改变MDA-MB-231细胞的生物学行为。接着，我们把构建的干扰EZH2表达的细胞提取了总RNA后送基因公司进行RNA-sequence检测，根据检测结果我们发现部分细胞紧密连接分子的表达情况发生了改变，于是设计了这些分子的引物进行了RT-pcr的验证。实验结果显示在shEZH2＃31、＃34两个不同靶点的MDA-MB-231细胞中，ITGA1、TMEFF1、LAMC2、ITGA2等分子都出现了不同程度的表达上升。同时，RNA-sequence的结果也提示引起改变的不仅仅是细胞紧密连接分子，细胞凋亡和细胞周期也与EZH2的表达密切相关。我们用AnnexinV-FITC试剂对构建的稳转细胞染色后进行了流式细胞分析，从结果我们得出了敲减EZH2基因表达后会促进MDA-MB-231细胞凋亡。我们也进行了PI染色后流式分析来检测不同细胞周期的变化，在三次重复试验中无论是在G1期还是G2期，敲减EZH2基因表达的细胞和对照组都没有明显的变化，但在S期，实验组的细胞比例相比对照组出现了下降。为了研究EZH2与细胞紧密连接分子表达的相关性，我们根据RNA-sequence结果中显示的差异基因，利用甲基化引物设计软件设计了相应的MSP引物，经过MSP实验验证后发现其中CLDN-4分子无论在对照组还是敲减组甲基化引物均能扩出阳性产物，说明了CLDN-4基因的启动子上存在甲基化。在敲减EZH2基因靶点的MDA-MB-231细胞中CLDN-4启动子CpG岛上的甲基化和非甲基化较对照组有所下降。为了进一步验证CLDN-4启动子上CpG岛甲基化水平的变化情况，我们设计了CLDN-4的BSP引物，采用跟前面MSP同样的实验方法进行了PCR扩增，并将扩增产物回收，回收后插入T载体做了TA克隆，挑取克隆后送基因公司测序，测序结果分析后发现在敲减EZH2基因不同靶点的MDA-MB-231细胞中，CLDN-4启动子中CpG岛的甲基化频率相比对照组都有下降，进一步表明EZH2参与了CLDN-4启动子的甲基化。
　　综上所述，我们可以得出结论：1）EZH2可能与三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖和迁移有关；2）乳腺癌的发生发展可能与EZH2引起的相关细胞紧密连接分子表达下降有关；3）乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖可能与EZH2介导的抑制肿瘤细胞凋亡及细胞周期S期活跃有关；4）在MDA-MB-231细胞中，EZH2参与了CLDN-4启动子的甲基化。