论文部分内容阅读
目的:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,发病率居女性恶性肿瘤的首位,已经成为当前社会的重大公共卫生问题。流行病学发现肥胖作为全球性健康问题是乳腺癌发病的重要危险因素之一,有研究表明肥胖是乳腺癌患者新辅助化疗病理完全应答降低的独立预后因素。瘦素(Leptin)作为重要的脂肪细胞因子,与肥胖的发生密切相关,瘦素及其受体(Leptin receptor,OBR)在乳腺癌中存在过度表达,研究表明瘦素与瘦素受体结合具有促进癌细胞增殖,抑制凋亡,诱导血管生成及促进乳腺癌转移的作用。然而有关瘦素及其受体与乳腺癌治疗疗效的关系尚无定论。核转录因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)是一种重要的核转录因子,研究表明,NF-κB信号通路在人类多种实体肿瘤的发生、发展及转移中起重要作用。核转录因子抑制蛋白激酶β(Inhibitor of nuclear factor kappa-β,IKKβ)是经典NF-κB信号通路中一种重要的激酶,激活后参与调节下游基因的转录。实验研究表明,条件性敲除或敲减肿瘤细胞中的IKKβ,能够明显抑制小鼠肺癌、黑色素瘤及胶质瘤等实体肿瘤的生长,提示IKKβ可能作为肿瘤临床治疗的潜在靶点之一。有文献报道,雌激素受体α(Estrogen receptorα,ERα)和NF-κB可以协同刺激肿瘤的增殖和药物抵抗,而瘦素可以影响ERα,并使其活化。但是,关于瘦素与NF-κB信号通路在乳腺癌中的作用关系目前未深入研究。本研究通过检测瘦素和瘦素受体在新辅助化疗后病理完全缓解(Pathological complete remission,PCR)组、非PCR组、疾病进展(Disease progression,PD)组的表达情况,探讨瘦素及其受体与乳腺癌新辅助化疗病理完全应答率的关系,评估其对与新辅助化疗疗效及预后的价值。从基础实验角度探讨IKKβ对瘦素及其受体不同表达水平的乳腺癌细胞增殖凋亡及侵袭转移的影响,以及NF-κB信号通路与瘦素及其受体的相关机制,从而为乳腺癌的化疗提供可能的疗效预测及预后的参考指标,同时提供新的潜在治疗靶点,具有一定的指导意义。方法:首先收集我院2014年1月至2017年12月资料完整的乳腺癌患者325例,术前穿刺病理完整。对所有患者进行随访。采用免疫组化法检测患者石蜡切片组织中瘦素和瘦素受体的表达情况,分析瘦素和瘦素受体在PCR组、非PCR组、PD组的表达情况及其与分子分型及患者预后等的关系。然后通过病毒转染技术敲减乳腺癌细胞中的IKKβ,采用MTT、流式细胞术、细胞划痕实验、克隆形成实验等实验方法观察IKKβ对瘦素及其受体不同表达水平的乳腺癌细胞增殖凋亡及转移的影响,通过RT-PCR法检测IKKβ信号通路相关基因的表达情况,探讨NF-κB信号通路与瘦素及其受体的相关机制。结果:1.PCR组中瘦素、瘦素受体阳性、强阳性表达率均较非PCR组高,但差异无统计学意义,提示瘦素和瘦素受体表达在PCR组、非PCR组无明显差异。PCR组中瘦素、瘦素受体阳性、强阳性表达率同样均较PD组高,其中瘦素受体表达情况两组间差异有统计学意义,瘦素表达情况两组间无明显差异,提示瘦素受体表达高的患者治疗效果更好。2.HER2阳性PCR组中瘦素、瘦素受体阳性、强阳性表达率均较PD组高,表达差异有统计学意义,提示HER2阳性患者中瘦素和瘦素受体高表达者治疗效果更好。3.瘦素及瘦素受体在HR阳性、HER2阳性、三阴性患者中表达阳性率差异有统计学意义,三阴性患者中瘦素、瘦素受体表达较HER2阳性、HR阳性患者高。4.瘦素高表达组(阳性及强阳性表达)与低表达组(弱阳性及阴性表达)疾病进展率分别为13.25%、11.32%;瘦素受体高表达组与低表达组疾病进展率分别为13.1%、10.42%,差异无统计学意义。提示瘦素及瘦素受体高表达者预后可能越差。5.在MCF-7细胞中瘦素及瘦素受体的表达水平分别为:1.005和1.015,在MDA-MB-231细胞中,瘦素及瘦素受体的表达的水平分别为:1.384和1.449,两种细胞表达差异均有统计学意义。利用慢病毒为载体,在体外可以成功感染乳腺癌细胞,成功敲减IKKβ的表达。6.敲减IKKβ后降低了MDA-MB-231细胞的活力,但是对MCF-7的影响不大,对两种细胞的细胞周期都有影响。敲减IKKβ后,使MDA-MB-231细胞的凋亡增加,MCF-7细胞凋亡率对比没有明显差别,MCF-7和MDA-MB-231细胞克隆数量均减少,差异均有显著性,对MDA-MB-231细胞的影响更为巨大。在MDA-MB-231上敲减IKKβ的表达后划痕迁移率明显下降,差异有显著性。7.敲减IKKβ后,MCF-7细胞中,瘦素及瘦素受体、IKBKG及P65、HIF的表达均下降,差异有统计学意义;然而在MDA-MB-231细胞中,瘦素及瘦素受体、IKBKG及P65的表达均升高,其中IKBKG升高差异有统计学意义,HIF的表达水平与对照组没有明显差别。结论:1.瘦素及瘦素受体高表达的患者新辅助化疗疗效可能更好,特别是对于HER2阳性患者。2.瘦素及瘦素受体的表达在不同分子分型中存在差异,可能对乳腺癌的预后有一定的预测价值。3.MDA-MB-231细胞中瘦素和瘦素受体表达水平较MCF-7细胞高,与临床研究一致。4.阻断NF-κB途径后MDA-MB-231细胞增殖、转移、凋亡均受抑制,MCF-7细胞增殖受抑制,凋亡无明显变化,两株细胞的差异有可能与瘦素及其受体表达水平不同有关。5.敲减IKKβ后MCF-7细胞中瘦素及瘦素受体表达水平下降,MDA-MB-231细胞中瘦素和瘦素受体表达水平升高,考虑NF-κB信号通路对MDA-MB-231中瘦素表达存在抑制作用,具体原因需进一步基础研究证实。6.阻断NF-κB途径后MDA-MB-231细胞中NF-κB通路相关基因表达增高,MCF-7细胞中NF-κB通路相关基因表达减低,考虑可能与瘦素及其受体表达水平不同有关。7.敲减IKKβ后,MCF-7细胞中HIF基因的表达减低,MDA-MB-231细胞不受影响。这种差异是否与瘦素及其受体相关仍需进一步验证。